应用根际促生细菌防治大豆胞囊线虫病的研究

论文摘要

本文针对大豆生产上危害严重的大豆胞囊线虫病筛选获得了可诱导大豆产生系统抗性的根际促生菌,并对其分类地位、摇瓶发酵条件、生防效果、定殖规律、作用机理等方面进行了系统的研究。研制了适宜生产的多功能PGPR制剂,并对其田间使用效果进行了反复论证,得出其可提高大豆产量,优化大豆品质,并可诱导大豆产生抗性。结果如下:1.将大豆种子用1069株细菌菌悬液包衣后,施于辽宁省、黑龙江省大豆胞囊线虫重发田。35天后调查表明,有14株细菌包衣后的大豆对大豆胞囊线虫有明显的抑制作用。第二年重复试验验证了生防细菌的诱导抗性作用,并且我们结合田间试验和室内测定结果从中成功筛选出5株抗大豆胞囊线虫的大豆根际促生细菌,分别为Sneb207、Sneb353、Sneb364、Sneb382、Sneb482,其中以Sneb207、Sneb482效果最好。2.在形态学和生理生化反应的基础上,通过分子生物学方法对上述根际促生菌进行分类鉴定,明确了筛选出的PGPR分类地位,共2属4种细菌。并首次报道了巨大芽孢杆菌对大豆胞囊线虫病的抑制作用。研究结果表明Sneb207、482均为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）,Sneb353为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,Sneb364为阴沟肠杆菌（Enterobactet cloacae）,Sneb382为成团肠杆菌（Enterobacter agglomerans）。3.对根际促生菌Sneb207、482的剂型进行了初步研究。采用灭菌发酵液制成的种衣剂处理豆种,经辽宁省、黑龙江省三地多次田间使用效果证明对大豆有显著的促生防病作用。经PGPR制剂包衣后的大豆对大豆胞囊线虫胞囊的抑制率可达38.12%～82.13%,胞囊线虫发病越重地块其诱导抗性表现越强。同时PGPR制剂可使大豆生育期缩短,出现早熟现象。对大豆产量影响显著,单株荚数和粒数均比对照增加2～4倍,单株粒重增重200～380%,百粒重增重14～40%,植株鲜重增加。起到提高大豆产量并优化大豆品质的作用。4.对Sneb207、482的培养条件进行了优化,获得了Sneb207、482的最佳配方。通过单因子试验和正交试验最终筛选出最佳碳氮源配方。菌株Sneb207的发酵配方为:蔗糖1.57%,牛肉膏0.897%,酵母浸膏0.842%。最佳摇瓶条件为:初始pH8.0、接种量为2%、装液量为40ml的100ml三角瓶在28℃、全光照振荡培养。菌株Sneb482的发酵配方为:蔗糖1.51%,牛肉膏0.836%,酵母浸膏0.68%。最佳摇瓶条件为:初始pH8.0、接种量为0.5%、装液量为30ml的100ml三角瓶在28℃、全光照振荡培养。5.通过逐步提高药物浓度的方法,获得了抗红霉素300μg/ml的Sneb207标记菌株,利用标记菌株来研究菌株Sneb207在大豆根部的定殖和消长规律。结果表明菌株Sneb207可在大豆根际及根内定殖、繁殖。说明其不仅可在土壤中大量繁殖,还是一株内生细菌。菌株在根际及根内的消长动态测定表明,菌量在接种15d左右出现高峰后逐渐下降。大豆促生菌Sneb207对根际环境适应性的研究结果表明:Sneb207引入后能与寄主植物、环境、土壤微生物等因素建立其新的生态平衡,形成一个“综合的生防体系”,以提高生物防治的稳定性和防效。且Sneb207可与化学农药和肥料同时使用,因此生物与化学防治结合,更有效的防治大豆根部土传病害。6.对Sneb207促进大豆生长的机理研究表明,Sneb207具有解钾、解磷、固氮等能力。Sneb207作为大豆根内生细菌,能够有效促进根瘤的形成,根瘤数明显增加且根瘤大,与大豆产生联合固氮作用;Sneb207可增加根系周围土壤中营养物质的可用性,分解土壤中难溶性的矿物,从而帮助植物吸收各种矿质元素:Sneb207对大豆根部生长和根部形态学有积极作用,另外Sneb207刺激质膜H+-ATP酶活力的显著增强,提高其磷酸化水平。从而调节大豆许多重要的生理功能,促进其生长发育。7.通过试验证明了Sneb207可诱导大豆产生抗线虫、真菌的广谱抗性。从Sneb207处理根部的冰冻切片发现了内部组织与对照相比有很大变化,抗病方面主要表现在Sneb207诱导后中柱鞘细胞加厚,结构更为紧密。大豆胞囊线虫的取食位点位于中柱鞘部位,其细胞越为紧密,线虫越不容易汲取养分,而无法维持其自身生长发育。因此即使线虫入侵到维管束组织内,也会有木质和酚类物质的大量沉积,细胞壁得到加厚,有效地阻止了线虫侵入,使其限制在木栓层和外皮层内。另外Sneb207处理大豆后还可以诱导大豆体内PPO、POD、PAL、SOD、CAT几种防御酶的活力提高。

论文目录

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前言

第一章植物根际促生菌的研究进展

一、微生物肥料研发现状

二、PGPR作为微生物肥料的研究进展

三、PGPR种类

四、PGPR与宿主植物的关系

五、PGPR作用机制

六、PGPR生防作用的不稳定性及可能的改进策略

第二章大豆根际促生细菌的筛选

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 大豆胞囊线虫生防菌株的筛选

2.2 大豆根际促生菌的田间筛选

2.3 大豆根际促生菌的室内筛选

2.4 大豆根际促生菌稳定性测试

3 小结

第三章大豆促生菌的鉴定

第一节大豆促生菌的形态学及生理生化性状分类

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 形态学特征

2.2 生理生化反应

3 小结

第二节细菌分子生物学（16SrDNA）手段鉴定

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 细菌基因组全DNA的提取

2.2 16SrRNA/DNA的PCR扩增产物

2.3 16SrRNA/DNA序列测定

2.4 大豆促生菌的系统发育关系

3 小结

第四章大豆促生菌制剂的初步研究

第一节大豆促生菌制剂的研制

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 两菌株的互作

2.2 不同剂型促生性比较

2.3 PGPR制剂效果测定

2.4 化肥对PGPR制剂的影响

3 小结

第二节大豆促生菌制剂的应用效果

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 生理小种的监测

2.2 PGPR制剂的生防效果

2.3 PGPR制剂对大豆苗期生长的影响

2.4 成熟期PGPR制剂对大豆生理指标的影响

3 小结

第五章大豆促生菌培养条件研究

1 材料和方法

2 结果与分析

2.1 菌量与吸光度相关性的测定

2.2 菌株生长曲线的测定

2.3 单因子试验

2.4 培养基优化正交试验

2.5 环境条件的影响

3 小结

第六章大豆促生菌生防效果的测定

1 材料和方法

2 结果与分析

2.1 菌悬液对各种靶标线虫的毒力测定

2.2 细菌发酵液对各种靶标线虫的毒力测定

2.3 不同稀释倍数的细菌发酵液对大豆胞囊线虫、北方根结线虫的毒力测定

2.4 不同稀释倍数的灭菌发酵液对大豆胞囊线虫、北方根结线虫的毒力测定

2.5 5×稀释发酵液对大豆胞囊线虫胞囊孵化的影响

2.6 细菌菌株对大豆根腐病原真菌拮抗性检测

3 小结

第七章大豆促生菌Sneb207定殖规律及对根际土壤微生物区系的影响

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 供试菌株天然抗药性检测

2.2 标记菌株与原始菌株的比较

2.3 标记菌株的稳定性检测

2.4 标记菌株回收检测

2.5 标记菌株在大豆根部的定殖动态

2.6 环境对菌株Sneb207定殖的影响

2.7 菌株Sneb207对土壤中可培养的主要微生物种群数量的影响

3 小结

第八章大豆促生菌Sneb207促生机理研究

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 解钾能力

2.2 解磷能力

2.3 对根部质子分泌作用的影响

2.4 联合固氮能力鉴定

2.5 硝酸还原酶NPA活力的测定

2.6 根系活力的测定

2.7 根系ATP酶活力的测定

3 小结

第九章根际促生菌Sneb207诱导大豆系统抗性的研究

第一节促生菌Sneb207诱导大豆系统抗性的验证

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 发病土壤内病原微生物的分离

2.2 ISR的发现

2.3 裂根法验证ISR

3 cfu/ml Sneb207发酵液对大豆胞囊线虫的毒力测定'>2.4 10³ cfu/ml Sneb207发酵液对大豆胞囊线虫的毒力测定

3 小结

第二节 PGPR诱导大豆物理结构的变化

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 大豆组织内线虫的染色

2.2 大豆根部冰冻切片

3 小结

第三节 PGPR诱导大豆防御酶系的变化

1 材料与方法

2 结果与分析

2.1 蛋白质含量的测定

2.2 过氧化物酶（POD）酶活的测定

2.3 多酚氧化酶（PPO）酶活的测定

2.4 苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活的测定

2.5 超氧化物歧化酶（SOD）酶活的测定

2.6 过氧化氢酶（CAT）酶活的测定

3 小结

第十章结论与讨论

1.大豆根际促生细菌的筛选及鉴定

2.大豆促生菌制剂的初步研究

3.大豆促生菌Sneb207的根际环境适应性

4.大豆促生菌Sneb207的促生机理

5.大豆促生菌Sneb207可诱导大豆产生系统抗性

6.展望

参考文献

致谢

附录

应用根际促生细菌防治大豆胞囊线虫病的研究

论文摘要

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