核盘菌与拟南芥互作的分子机制研究

论文摘要

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum（Lib．）de Bary）是世界粮油作物、蔬菜等农作物生产上的分布最广、为害最严重的病害之一。我国油菜、大豆和保护地蔬菜的菌核病问题尤为突出，严重时会导致毁灭性的损失。该菌寄主范围极广，不具典型的基因对基因关系，给研究其致病和抗病分子机制带来了极大的困难，至今对其侵染致病的分子机制和植物对核盘菌的抗性机制仍不甚明了。为了研究植物对核盘菌的抗性机制，采用从拟南芥病株上分离鉴定的核盘菌菌株接种拟南芥野生型Col-4，分别于接种后0、4、8、12、16、20、24、48取样，提取各样本的总RNA，以PR1（Pathogenosis-related protein 1）和PDF1.2（plant defensin 1.2）基因片段为探针进行Northern blot杂交，分析核盘菌侵染后拟南芥病程相关蛋白基因的表达动态，同时对相应时间段的病菌侵染过程及组织和症状变化进行了观察。Northern blot分析表明：PDF1.2在接种12h后开始表达，在之后的4个时间段其表达量逐步增强；而PR1在整个过程中表达量变化不大。扫描电镜观察及组织和症状观察结果表明，接种8h时菌丝开始围绕植物表面细胞生长，菌丝顶端膨大产生许多分支，并形成一些小的侵染垫，但植物叶片上还没有病斑形成；12h时在菌丝块周围可以清楚的看见旺盛生长的气生菌丝，菌丝块下面及周围的叶片上开始产生零星病斑，16h时零星病斑连成片，20h病斑进一步扩大，在菌丝块周围可明显的看到褐色病斑，24h时病斑已达到一定规模，病斑表面可见有许多气生菌丝，在病斑边缘可见有菌丝顶端从表皮下面伸出并形成许多分支，但此时的病斑还接近圆形，等到30h时由于菌丝沿叶脉生长得快，病斑呈现椭圆形或梭形。综合以上的结果，我们认为PDF1.2的表达动态与拟南芥-核盘菌亲和互作的过程存在对应关系，推出拟南芥对核盘菌的抗性反应可能受茉莉酸／乙烯信号途径调控。 鉴于PDF1.2基因的表达情况，选取4h、12h、24h、48h四个时间段的拟南芥材料，以接种核盘菌拟南芥mRNA作为tester，正常组织的mRNA为driver进行抑制消减杂交，将抑制消减杂交的第二轮PCR产物克隆进T载体构建包括2592个克隆的cDNA文库。以正向探针（接种核盘菌的拟南芥mRNA作为tester，未接种对照组织的mRNA为driver，进行SSH实验后的第二轮PCR产物）和反向探针（接种核盘菌的拟南芥mRNA作为driver，正常组织的mRNA为test，进行SSH实验后的第二轮PCR产物）进行菌落杂交筛选cDNA文库，将获得的差异克隆以接种和未接种的拟南芥样品cDNA为探针进行反向Northern blot分析进一步鉴定出受核盘菌诱导表达的拟南芥防御反应相关基因。挑取反向Northern blot杂交结果差异明显的46个克隆进行测序，共得到38个拟南芥的非冗余序列。进一步分析这些基因的功能，结果发现已知功能的序列有22条（57％），未知功能的序列16条（43％）；防卫基因和信号传导蛋白基因占所有基因的18％。RT-PCR分析表明这些基因确实是由核盘菌诱导表达的。为了进一步验证SSH的结果，从ABRC库中得到部分基因的T-DNA插入失活突变体，经接种核盘菌后发现几乎所有的突变体对核盘

论文目录

• 独创性声明
• 论文使用授权的说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述与研究背景
• 1 植物抗病机制研究进展
• 1.1 植物与病原物相互作用的一般概念
• 1.2 植物抗病基因的结构、功能及其作用机制
• 1.2.1 NBS-LRR类蛋白
• 1.2.2 胞外LRR蛋白（LRR-TM）
• 1.2.3 跨膜受体激酶类（LRR-TM-PK）蛋白
• 1.2.4 胞内丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶（S／TK）
• 1.2.5 其它类型的R基因
• 1.3 R基因与avr基因的识别
• 1.4 植物R基因介导的信号传递
• 1.5 植物抗病防卫反应的基本信号通路
• 1.5.1 SA信号传导途径
• 1.5.2 JA／ET信号传导途径
• 1.5.3 信号途径之间的交流
• 1.6 数量抗病性
• 2 核盘菌
• 2.1 生物学特性
• 2.2 致病机制
• 2.3 抗病研究进展
• 3 拟南芥的功能基因组学研究
• 4 功能基因组学研究方法
• 4.1 分析基因差异表达鉴定基因功能的研究方法
• 4.2 反向遗传学鉴定基因功能的研究方法
• 4.2.1 基因敲除（Gene disruption）
• 4.2.2 RNAi和基因沉默（Gene silencing）
• 4.2.3 利用嵌合RNA／DNA寡聚核苷酸（CO）产生特定基因突变
• 4.2.4 基因陷阱（Gene trap）
• 4.2.5 T-DNA标签
• 4.2.6 转座子标签
• 第二章 拟南芥——核盘菌病害系统分析
• 1 材料与方法
• 1.1 拟南芥的种植
• 1.2 菌核病菌的分离
• 1.3 菌核的低温处理及子囊盘的诱导
• 1.4 子囊孢子细胞形态观察
• 1.5 菌核病菌的培养与接种
• 1.6 发病过程观察
• 1.6.1 组织染色观察
• 1.6.2 扫描电镜观察
• 1.7 拟南芥基因组DNA的提取
• 1.8 杂交探针的制备
• 1.9 总RNA的提取及鉴定
• 1.9.1 异硫氰酸胍一步法提取总RNA
• 1.9.2 总RNA的鉴定
• 1.10 Northern blot杂交
• 1.10.1 RNA在膜上的转移及固定
• 1.10.2 探针的标记
• 1.10.3 预杂交和杂交
• 1.10.4 洗膜及放射自显影
• 1.11 RT-PCR
• 1.12 菌核病菌基因组DNA的提取
• 1.13 菌核病菌18SrDNA的PCR扩增
• 1.14 核酸序列数据的分析和系统树构建
• 2 结果分析
• 2.1 菌核病菌在自然条件下的病组织上和PDA上均可形成黑色的菌核
• 2.2 菌核的萌发及子囊盘的形成过程
• 2.3 子囊及子囊孢子的细胞形态观察
• 2.4 LSU rDNA的获得及系统分类地位的确定
• 2.5 菌核病菌接种拟南芥后的症状发展过程
• 2.6 总RNA的鉴定
• 2.7 PR1和PDF1.2的表达变化
• 3 讨论
• 3.1 菌核病病原的确定
• 3.2 拟南芥-核盘菌病害研究系统的确定
• 第三章 核盘菌诱导拟南芥特异表达基因的获得与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 拟南芥的种植
• 1.2 核盘菌的培养与接种
• 1.3 总RNA的提取及鉴定
• 1.4 mRNA的分离纯化与浓缩
• 1.5 抑制消减杂交（SSH）
• 1.5.1 cDNA第一链的合成
• 1.5.2 cDNA第二链的合成
• 1.5.3 双链cDNA的Rsa Ⅰ酶切
• 1.5.4 cDNA两端接头的连接
• 1.5.5 第一次杂交反应
• 1.5.6 第二次杂交
• 1.5.7 PCR扩增反应
• 1.6 抑制差减cDNA文库的构建
• 1.6.1 PCR产物的连接
• 1.6.2 连接产物的转化
• 2法转化'>1.6.2.1 CaCl₂法转化
• 1.6.2.2 电击法转化
• 1.6.3 转化重组子的鉴定
• 1.6.4 消减文库质量鉴定
• 1.7 菌落杂交筛选差异表达克隆
• 1.7.1 杂交膜的制备
• 1.7.2 杂交探针的准备
• 1.7.3 菌落杂交
• 1.8 Reverse Northern blot
• 1.8.1 PCR产物凝胶电泳
• 1.8.2 膜的吸印及DNA固定
• 1.8.3 探针的标记和杂交
• 1.8.4 洗膜及放射自显影
• 1.9 差异表达基因序列的测定及其功能分析
• 1.10 RT-PCR
• 1.11 T-DNA插入失活突变体抗性评价
• 2 结果与分析
• 2.1 mRNA的分离纯化及浓缩
• 2.2 抑制消减杂交的效果分析
• 2.3 cDNA消减文库质量鉴定
• 2.4 菌落杂交筛选差异表达克隆
• 2.5 反向Northern blot杂交进一步筛选差异表达基因
• 2.6 差异表达基因序列的测定及其功能分析
• 2.7 RT-PCR分析差异表达基因
• 2.8 T-DNA插入失活突变体对核盘菌的敏感性鉴定
• 3 论论
• 3.1 抑制消减杂交方法的应用
• 3.2 核盘菌侵染诱导的拟南芥cDNA文库
• 第四章 拟南芥抗菌核病激活标签突变体库的构建获得及遗传分析
• 1 材料与方法
• 1.1 拟南芥的种植
• 1.2 浸花法转化拟南芥
• 1.3 BASTA筛选转化植株
• 1.4 突变体中T-DNA插入拷贝数分析
• 1.5 PCR扩增检测拟南芥转化株
• 1.6 农杆菌继代培养过程中增强子存在情况的观察分析
• 1.7 核盘菌的培养与接种
• 1.8 抗病性的验证
• 1.9 T-DNA侧翼序列的获得与分析
• 1.10 RNA的提取
• 1.11 RT-PCR
• 1.12 T-DNA插入失活突变体抗性评价
• 2 结果与分析
• 2.1 拟南芥转化条件的优化分析
• 2.2 拟南芥突变体库的分析
• 2.3 菌核病抗性增强的激活标签突变体筛选
• 2.4 菌核病抗性增强突变体的分子遗传分析
• 3 讨论
• 3.1 关于拟南芥转化条件的优化
• 3.2 关于增强子的丢失
• 3.3 关于增强子对附近基因的影响
• 3.4 用激活标签突变体筛选数量性状控制的抗性材料是切实可行的
• 第五章 At3g62690、At3g62670、At4g16260、At5g16050、At1g30280基因的克隆及亚细胞定位
• 1 材料与方法
• 1.1 拟南芥的种植
• 1.2 拟南芥基因组DNA的提取
• 1.3 At3g62690、At3g62670、At4g16260、At5g16050、At1g30280基因的克隆
• 2法制备大肠杆菌感受态细胞'>1.4 CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞
• 1.5 农杆菌感受态细胞的制备
• 1.6 Gateway反应步骤
• 1.6.1 BP反应
• 1.6.2 LR反应
• 1.7 转化农杆菌
• 1.8 拟南芥的转化及突变体的筛选
• 1.9 利用洋葱表皮瞬时表达系统表达侯选基因GFP融合蛋白
• 1.9.1 洋葱表皮细胞的准备
• 1.9.2 质粒DNA的纯化和金粉包埋
• 1.9.3 用基因枪法在洋葱表皮细胞中导入外源质粒
• 1.9.4 侯选基因GFP融合蛋白亚细胞定位的显微镜观察
• 2 结果与分析
• 2.1 At3g62690、At3g62670、At4g16260、At5g16050、At1g30280基因的克隆
• 2.2 转化子的筛选
• 2.3 At1g30280蛋白的结构预测及亚细胞定位
• 2.4 At5g16050蛋白的结构预测及亚细胞定位
• 3 讨论
• 3.1 Gateway克隆技术适用于大规模基因的克隆
• 3.2 At1g30280和At5g16050的亚细胞定位分析
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 致谢