拟南芥植物硫肽激素基因的克隆及其在玫瑰茄细胞中的表达

论文题目: 拟南芥植物硫肽激素基因的克隆及其在玫瑰茄细胞中的表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 发酵工程

作者: 谢秀祯

导师: 郭勇

关键词: 拟南芥植物硫肽激素基因,植物肽类生长因子,根癌农杆菌介导的遗传转化,植物细胞增殖,玫瑰茄

文献来源: 华南理工大学

发表年度: 2005

论文摘要: 植物细胞培养技术在中药、植物药以及其他天然化合物的生产中具有巨大的潜力，它能从根本上解决传统方法(包括化学合成、从野生植物材料中提取、人工栽培)所面临的资源和环保问题。然而，由于植物细胞生长速度慢、生产周期长、且易招致染菌，极大地阻碍了这一技术的产业化发展。本研究通过建立一个高效的玫瑰茄细胞遗传转化体系，然后利用这一转化体系将来自拟南芥的植物硫肽激素基因AtPSK2导入玫瑰茄细胞，并实现功能性表达，以期获得在低密度条件下能启动细胞分裂和增殖的转基因细胞系。主要的研究结果如下： 1．以根癌农杆菌LBA4404(pBI121)和EHA105(pBI121)为供体菌株，对玫瑰茄外植体遗传转化的基本条件进行了系统的研究，初步建立了两个有效的玫瑰茄细胞遗传转化体系。不论采用无菌苗的下胚轴切段或子叶切块还是愈伤组织作受体材料，均能获得稳定表达GUS活性的转化愈伤组织和稳定表达NPTⅡ活性的转化细胞系。但用无菌苗的下胚轴切段或子叶切块作受体材料，其转化率远远高于用愈伤组织作受体材料时的转化率，前者为29.4％，而后者仅有4％。采用愈伤组织作受体材料时，使用乙酰丁香酮作诱导物，可大大提高转化率。另外，农杆菌LBA4404菌株更适合于玫瑰茄的遗传转化。 2．根据拟南芥基因组数据库提供的序列信息设计引物，通过对PCR反应体系和反应条件进行优化，将变性温度提高到96℃，并分段采用两个不同的退火温度，最终从拟南芥总DNA中克隆到AtPSK2基因和AtPSK3基因。序列分析表明它们的核苷酸序列与拟南芥基因组数据库的完全相同，两者分子大小分别为412bp和505bp，均由一个大内含子和两个外显子组成，但都不含5′-和3′-UTR序列。 3．通过用AtPSK2基因取代pBI121质粒上的gus基因，构建了一个重组表达载体pBI-PSK2，然后利用本研究建立的遗传转化法将之导入到玫瑰茄细胞中，获得卡那霉素抗性的玫瑰茄细胞系和愈伤组织，PCR检测证明了AtPSK2基因及其表达调控元件已经整合到玫瑰茄细胞的基因组中。 4．利用低密度的玫瑰茄细胞培养系统检测到了拟南芥植物硫肽激素基因AtPSK2在玫瑰茄细胞中实现了功能性表达，表现出在低密度条件下促细胞分裂与增殖的活性；另外，利用固体培养还检测到AtPSK2基因促愈伤组织生长活性，转化愈伤组织的比生长速率比对照提高了75％。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 利用植物细胞培养技术生产天然化合物

1.1.1 植物单细胞培养技术

1.1.2 高产、稳定细胞系的选育

1.1.3 前景展望

1.2 植物的遗传转化

1.2.1 植物外源基因表达的工具

1.2.2 植物的遗传转化方法

1.2.3 转基因植物的检测与鉴定

1.2.4 遗传转化中的转基因沉默及其对策

1.3 植物肽类生长因子——植物硫肽激素-α的研究进展

1.3.1 PSK-α的发现

1.3.2 PSK-α的生理功能

1.3.3 PSK基因及其结构特点

1.3.4 PSK-α前体的结构及加工

1.3.5 PSK基因在转化细胞中的表达

1.3.6 PSK-α的受体

1.4 本课题研究的意义及主要内容

1.4.1 本课题研究的意义

1.4.2 本课题研究的主要内容

第二章 农杆菌介导的玫瑰茄细胞遗传转化体系的建立

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 方法

2.2 结果与讨论

2.2.1 农杆菌介导玫瑰茄外植体遗传转化体系的建立

2.2.2 农杆菌介导的玫瑰茄愈伤组织遗传转化体系的建立

2.2.3 抗性愈伤组织的获得及其检测

2.2.4 抗性细胞系的获得及其检测

2.3 本章小结

第三章 拟南芥植物硫肽激素基因的克隆及序列分析

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果与讨论

3.2.1 拟南芥总DNA的提取与纯化

3.2.2 从拟南芥总DNA中扩增AtPSK2和AtPSK3基因

3.2.3 PCR产物的克隆及重组子的鉴定

3.2.4 AtPSK2和AtPSK3基因的序列测定与分析

3.3 本章小结

第四章 重组表达载体的构建及转基因玫瑰茄细胞系的获得与鉴定

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 结果与讨论

4.2.1 重组表达载体的构建及鉴定

4.2.2 转基因玫瑰茄细胞系的获得及检测

4.3 本章小结

第五章 拟南芥植物硫肽激素基因在玫瑰茄细胞中的表达

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.2 方法

5.2 结果与讨论

5.2.1 AtPSK2基因促细胞分裂活性的检测

5.2.2 AtPSK2基因促愈伤组织生长活性的检测

5.2.3 转基因玫瑰茄细胞中花黄素含量的测定

5.3 本章小结

结论与展望

参考文献

攻读博士学位期间发表论文情况

致谢

附录1

附录2

附录3

发布时间: 2006-10-18

参考文献

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