疥螨原肌球蛋白基因的克隆、表达与蛋白定位研究

论文摘要

疥螨病是一种常见的人兽共患寄生虫病,具有高度传染性,能导致人和动物剧痒及各种类型的皮炎,是一种顽固性、接触性、传染性皮肤病。长期药物治疗疥螨病存在药物残留、环境污染等问题。目前尚无可用于免疫防治的疥螨疫苗。尽管寄生虫疫苗的研制较为困难,但相信随着分子生物学的不断发展,疥螨基因文库的不断完善,疥螨基因工程疫苗将会成为防治疥螨病最有前景的方法之一本研究参考GenBank中收录的粉尘螨（D17682）、屋尘螨（AF016278）和痒螨（AM114276）原肌球蛋白（Tropomyosin）基因序列设计引物,对提取的疥螨总RNA进行RT-PCR扩增与克隆,测序结果得到了855bp的目的基因片段。通过对该基因核苷酸序列进行分析,与已报道的粉尘螨、屋尘螨和痒螨原肌球蛋白（Tm）基因的序列同源性分别为87.60%,85.26%和85.03%。预测其表达的重组蛋白大小约为50.90kDa,理论等电点值为pI=4.43,具有很强的亲水性。推导的化学式为C[39] H2318N412O4878S10,带负电荷。该蛋白不存在信号肽切割位点,也不存在跨膜结构域,是一种膜外蛋白。将目的片段插入pET32a（+）表达载体上,将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,用浓度为1.0mM/L的IPTG诱导表达了疥螨原肌球蛋白,通过SDS-PAGE分析表明,在相对分子质量约50kDa处有明显的表达条带。进一步优化诱导表达条件,结果表明该重组蛋白在37℃温度下,IPTG浓度为0.4mol/L,诱导4h时基本达到最大表达量。用兔疥螨阳性血清作为一抗进行免疫印迹反应,发现重组表达蛋白可与兔疥螨阳性血清反应,产生蛋白免疫印迹带,说明表达的重组蛋白具有抗原性。将纯化的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备乳剂苗,用其免疫家兔,获得高免血清,并通过免疫组织化学SP技术,对疥螨原肌球蛋白进行组织定位,试验结果表明该蛋白主要在疥螨口器和四肢的肌肉,躯体表皮以及内脏器官表膜中表达。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1. 动物疥螨病研究进展
• 1.1 流行病学
• 1.2 生物学
• 1.2.1 生活史
• 1.2.2 生活习性
• 1.3 治病作用与临床症状
• 1.4 病理变化
• 1.4.1 组织病理学变化
• 1.4.2 血液的病理学变化
• 1.5. 免疫学
• 1.5.1 抗原研究
• 1.5.2 疥螨引起的免疫应答
• 1.6 疥螨的分子生物学
• 1.6.1 疥螨遗传学研究
• 1.6.2 疥螨cDNA文库的构建
• 1.6.3 疥螨表达序列标签（EST）分析
• 1.6.4 疥螨的抗原基因
• 1.6.4.1 副肌球蛋白
• 1.6.4.2 载脂蛋白
• 1.6.4.3 谷胱甘肽S转移酶
• 1.6.4.4 半胱氨酸蛋白酶
• 1.6.4.5 原肌球蛋白
• 1.7 诊断
• 1.7.1 病原学诊断
• 1.7.2 免疫学诊断
• 1.7.2.1 血凝抑制实验
• 1.7.2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 1.7.2.3 聚合酶链反应（PCR）
• 1.8 治疗
• 1.9 展望
• 2 本试验的目的意义
• 第二章 疥螨原肌球蛋白的克隆、原核表达与蛋白定位研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 试验样品来源
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 菌株及质粒载体
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.1.5 主要溶液的配制
• 1.1.6 主要生物信息数据库和计算机软件
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 兔疥螨的采集与纯化
• 1.2.2 形态学观察鉴定
• 1.2.3 疥螨原肌球蛋白的克隆
• 1.2.3.1 疥螨总RNA的提取
• 1.2.3.2 引物设计
• 1.2.3.3 原肌球蛋白基因的RT-PCR扩增
• 1.2.3.4 PCR产物的回收
• 1.2.3.5 目的基因的连接及转化
• 1.2.3.6 菌落PCR鉴定
• 1.2.3.7 目的基因序列的测定
• 1.2.4 疥螨原肌球蛋白基因的原核表达载体构建
• 1.2.4.1 表达引物的设计
• 1.2.4.2 表达基因的亚克隆
• 1.2.4.3 重组T克隆质粒的构建
• 1.2.4.4 原肌球蛋白的T克隆质粒的提取与酶切
• 1.2.4.5 pET32a（+）质粒的提取与酶切
• 1.2.4.6 酶切回收的原肌球蛋白质粒与pET32a（+）质粒的连接与转化
• 1.2.4.7 重组表达质粒双酶切鉴定
• 1.2.4.8 重组表达质粒测序鉴定
• 1.2.5 重组质粒pET32a（+）-Tm在大肠杆菌中的诱导表达
• 1.2.5.1 重组蛋白的表达和样品的制备
• 1.2.5.2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 1.2.5.3 诱导剂IPTG浓度的优化
• 1.2.5.4 诱导表达时间的优化
• 1.2.5.5 诱导表达温度的优化
• 1.2.5.6 表达蛋白的可溶性分析
• 1.2.6 重组蛋白的纯化
• 1.2.7 重组pET32a（+）-Tm质粒表达产物免疫印迹
• 1.2.7.1 一抗血清的制备
• 1.2.7.2 SDS-PAGE凝胶电泳
• 1.2.7.3 表达产物转移至纤维素NC膜（半干式转移）
• 1.2.7.4 免疫印迹
• 1.2.8 制备高免血清
• 1.2.8.1 重组蛋白的制备
• 1.2.8.2 蛋白乳剂苗制备
• 1.2.8.3 免疫程序
• 1.2.8.4 间接ELISA检测高免血清的效价
• 1.2.8.5 免疫组织化学
• 2 结果
• 2.1 原肌球蛋白的克隆
• 2.1.1 原肌球蛋白的PCR扩增
• 2.1.2 重组质粒的PCR鉴定
• 2.1.3 重组克隆质粒的序列鉴定
• 2.1.4 重组质粒的序列分析
• 2.1.5 疥螨原肌球蛋白的蛋白质生物信息学分析
• 2.1.5.1 原肌球蛋白基因的碱基组成分析
• 2.1.5.2 氨基酸翻译和蛋白质组分分析
• 2.1.5.3 重组原肌球蛋白的信号肽位点预测
• 2.1.5.4 蛋白质跨膜区预测
• 2.1.5.5 蛋白质疏水性分析
• 2.2 疥螨原肌球蛋白基因的亚克隆
• 2.2.1 加酶切位点引物的PCR扩增
• 2.2.2 重组质粒pMD19-T-Tm的PCR与酶切鉴定
• 2.3 疥螨原肌球蛋白基因重组表达质粒的构建与鉴定
• 2.3.1 重组表达质粒的双酶切鉴定
• 2.3.2 重组表达质粒的序列鉴定
• 2.4 重组表达质粒的诱导表达
• 2.5 重组质粒表达条件的优化
• 2.5.1 IPTG浓度的优化
• 2.5.2 诱导时间的优化
• 2.5.3 诱导温度的优化
• 2.6 重组表达蛋白可溶性分析
• 2.7 重组蛋白表达产物纯化结果
• 2.8 融合蛋白表达产物免疫印迹结果
• 2.9 免疫组织化学
• 3. 讨论
• 第三章 结论与创新点
• 1 结论
• 2 创新点
• 参考文献
• 致谢