油菜LACS1基因和油菜LACS4基因的克隆与鉴定

论文摘要

长链酰基辅酶A合成酶（LACS）把游离脂肪酸活化成为酰基辅酶A,从而在生物的脂肪酸的合成代谢和分解代谢中起着重要的作用。这类重要的酶参与了若干种与脂肪酸相关的代谢,包括磷脂、甘油三脂、茉莉酸的生物合成以及脂肪酸的β-氧化等。在油料作物中克隆、分析和鉴定LACS对于油脂代谢的研究具有重要意义。本研究中利用拟南芥LACS1（AtLACS1）基因为探针,通过RACE技术,在油菜花的cDNA中克隆出一个全长为2334bp的LACS基因,命名为BnLACS1,并对其进行生物信息学分析。结果表明,BnLACS1含有一个长度为1983bp的开放阅读框（ORF）,预测编码一个含有660个氨基酸残基的蛋白。序列分析显示,BnLACS1属于AMP-绑定蛋白（AMPBP）超家族,编码蛋白序列同AtLACS1具有高度的一致性。BnLACS1序列已递交GenBank数据库（Acc.No.EU375561）。为了鉴定BnLACS1的功能,进行了酵母互补实验。结果证明BnLACS1编码LACS活性。底物偏好性分析表明,长链脂肪酸和饱和脂肪酸是BnLACS1偏好的底物。使用RT-PCR对BnLACS1进行了表达分析,发现BnLACS1在成熟的花和茎中有大量表达,而在萌发期的幼苗中没有表达。BnLACS1在同含油量油菜品系的角果皮和种子的表达水平也存在差异。这些结果说明,BnLACS1可能参与油菜油脂的合成,并且影响到种子的含油量。在本研究中,构建了BnLACS1的植物表达载体,并进行了转化油菜。为下一步的检测BnLACS1在油菜中过量表达引起的表型提供了基础。另一个油菜LACS基因以AtLACS4为探针,通过电子克隆得到,命名为BnLACS4。该基因长2,270bp,含有2,004bp的ORF。对进BnLACS4行生物信息学分析,表明BnLACS4编码一个含有667个氨基酸残基的蛋白。序列分析显示,BnLACS4具有真核生物LACS的分子特征。表达分析显示,BnLACS4在根、茎、叶、花中都有大量表达。在不同含油量油菜品系的角果皮和种子中,BnLACS4表达也不同。这说明,BnLACS4也有可能参与了油脂的合成代谢。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 长链酰基辅酶A合成酶（LACS）
• 1.2 长链酰基辅酶A参与的反应
• 1.2.1 油脂的合成
• 1.2.2 脂肪酸的β-氧化
• 1.3 本研究的目的和意义
• 1.4 主要研究内容和技术路线
• 1.4.1 主要研究内容
• 1.4.2 技术路线
• 第二章 油菜LACS1基因的克隆鉴定及生物信息学分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料和菌种
• 2.1.2 酶和试剂
• 2.1.3 基本溶液的配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 引物设计与合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 植物总RNA的提取
• 2.2.2 除去RNA中的基因组DNA
• 2.2.3 反转录
• 2.2.4 3'RACE
• 2.2.5 连接反应
• 2.2.6 大肠杆菌热击感受态的制备
• 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的热击转化
• 2.2.8 SDS-碱裂解法小量抽提质粒DNA
• 2.2.9 生物信息学分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 BnLACS1基因的克隆
• 2.3.2 生物信息学分析
• 2.3.3 分子进化分析
• 2.4 讨论与小结
• 第三章 油菜LACS1的功能鉴定与表达分析
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 植物材料和菌种
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 基本溶液
• 3.1.4 酵母培养基
• 3.1.5 引物设计
• 3.2 方法
• 3.2.1 酵母表达载体pYES2-BnLACS1的构建
• 3.2.2 酵母感受态细胞的制备
• 3.2.3 重组质粒转化酵母感受态细胞
• 3.2.4 互补缺陷型酵母YB525
• 3.2.5 RT-PCR
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 重组质粒pYES2-BnLACS1的鉴定
• 3.3.2 BnLACS1的功能鉴定
• 3.3.3 BnLACS1的底物偏好性分析
• 3.3.4 BnLACS1在萌发期和成熟组织中的表达分析
• 3.3.5 BnLACS1在不同含油量种子中的表达分析
• 3.4 讨论与小结
• 第四章 油菜LACS1基因植物表达载体的构建
• 4.1 材料和试剂
• 4.1.1 植物材料、菌种和试剂
• 4.1.2 基本缓冲液
• 4.1.3 引物设计与合成
• 4.2 方法
• 4.2.1 Napin启动子的获得
• 4.2.2 双元表达载体pCAMBIA2200-Napin的构建
• 4.2.3 表达载体pCAMBIA2200-Napin-BnLACS1的构建
• 4.2.4 农杆菌感受态细胞的制备
• 4.2.5 冻融法转化农杆菌感受态细胞
• 4.2.6 阳性克隆的鉴定和保存
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 重组质粒pCAMBIA2200-Napin的鉴定
• 4.3.2 表达载体pCAMBIA2200-Napin-BnLACS1的鉴定
• 4.3.3 重组质粒转化农杆菌的鉴定
• 4.4 讨论与小结
• 第五章 油菜LACS4基因的电子克隆和分析
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 酶和试剂
• 5.1.3 方法
• 5.1.4 生物信息学分析
• 5.1.5 引物设计与合成
• 5.1.6 RT-PCR
• 5.2 结果和分析
• 5.2.1 BnLACS4的EST分析
• 5.2.2 BnLACS4的电子克隆
• 5.2.3 BnLACS4 cDNA的序列分析
• 5.2.4 分子进化分析
• 5.2.5 BnLACS4的表达分析
• 5.3 讨论与小结
• 第六章 总结与展望
• 6.1 主要工作总结
• 6.2 工作展望
• 参考文献（References）
• 致谢
• 在学期间发表论文
• 参加课题