凡纳滨对虾血蓝蛋白免疫学活性及其作用机制的研究

论文摘要

对虾养殖是世界各地尤其是热带地区发展中国家的重要经济产业。随着对虾养殖业的迅速发展,传染性疾病特别是细菌性病和病毒性病给养殖业造成了巨大损失。因此,深入研究对虾抗病机制,大力推进虾类免疫学研究是最终战胜虾类病害的重要基础。近年来研究表明,存在于虾血淋巴中的血蓝蛋白是一种具有抗病毒和抗细菌等多种免疫活性的多功能蛋白。本研究以凡纳滨对虾血蓝蛋白为研究对象,在国内外所获研究结果的基础之上,进一步对其免疫学活性及作用机理进行研究,为丰富虾类免疫系统研究,探索对虾疾病免疫学防治奠定基础。实验结果显示,用2种不同抗体亲和纯化所得2种血蓝蛋白:LHt（抗体为兔抗血蓝蛋白全蛋白）和LH75（抗体为兔抗血蓝蛋白75 kDa亚基）。其均由75 kDa和77 kDa 2个亚基组成;糖含量分别为1.5%和3%,通过凝集素印迹检测到血蓝蛋白含α-D甘露糖/α-D葡萄糖、α-D-N-乙酰半乳糖胺、α-L-海藻糖和β-D-半乳糖（1-3）-D-乙酰半乳糖胺四种糖基,其中,LH75中α-D甘露糖/α-D葡萄糖含量为LHt的1.2倍,α-D-N-乙酰半乳糖胺含量为后者的1.5倍,说明血蓝蛋白在糖基化修饰水平存在多样性。对两种血蓝蛋白进行细菌凝集实验发现,LH75凝集活性明显高于LHt,前者为后者的4倍。凝集抑制实验表明,细菌外膜蛋白可以抑制血蓝蛋白对大肠杆菌K12、副溶血弧菌、溶藻酸弧菌、河弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌等7种细菌的凝集活性。血蓝蛋白对大肠杆菌外膜蛋白敲除菌凝集结果显示,血蓝蛋白对△OmpX的凝集特异性明显降低,推测OmpX为血蓝蛋白与病原菌的凝集作用靶标。体外抑菌实验表明,血蓝蛋白对大肠杆菌K12和副溶血弧菌、溶藻酸弧菌等8种虾类致病菌均有抑制作用,但LHt和LH75抑菌效果存在显著性差异。通过血蓝蛋白对大肠杆菌K12外膜蛋白敲除菌抑菌实验发现,与大肠杆菌K12野生菌株相比,血蓝蛋白对△OmpC、△OmpW、△OmpFDL和△O mpTSX抑菌活性明显降低,推测OmpC、OmpW、OmpFDL和OmpTSX可能为血蓝蛋白与病原菌的抑菌作用靶标。溶血实验显示,血蓝蛋白对多种动物红细胞表现出依赖于Ca2+的溶血活性,且LH75溶血活性明显高于LHt。血蓝蛋白溶血活性pH 6.0时最高,在pH 6～10,溶血活性随pH值升高而降低。血蓝蛋白浓度与溶血活性表现出剂量-效应正相关,表明血蓝蛋白分子协同作用引起溶血。渗透保护实验发现随着加入的渗透保护剂分子的增大,溶血活性降低,表明血蓝蛋白溶血机制可能为胶体渗漏机制。通过对血蓝蛋白处理后的红细胞膜进行SDS-PAGE及免疫印迹分析发现,血蓝蛋白以聚合物形式紧密结合到红细胞膜上。由此可以认为,血蓝蛋白的溶血机制可能为:血蓝蛋白以聚合体的形式紧密结合到红细胞膜上形成离子渗透孔,引起胶体渗漏导致溶血。至于血蓝蛋白分子与红细胞膜作用靶标还需进一步研究证实。综上所述,本课题研究主要发现:①凡纳滨对虾血蓝蛋白具有凝集、抑菌和溶血活性;②血蓝蛋白具有糖基修饰多样性,其糖含量高低与其免疫学活性呈正相关;③血蓝蛋白与病原菌的作用靶标为外膜蛋白,其中凝集作用和抑菌作用靶标分别为OmpX和OmpC、OmpW、OmpFDL、OmpTSX;④血蓝蛋白溶血机制为胶体渗漏机制。所获研究结果为揭示血蓝蛋白的免疫学分子作用机制,阐明血蓝蛋白与病原菌的识别模式奠定了良好的基础,同时为研究血蓝蛋白在对虾中的免疫抗病作用提供了较好的实验依据,对丰富和发展甲壳类动物免疫系统的基础研究及指导免疫学防治具有重要的意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 前言
• 1.1 对虾养殖概况
• 1.2 对虾的免疫机制
• 1.2.1 器官免疫
• 1.2.2 细胞免疫
• 1.2.3 体液性免疫因子免疫
• 1.3 血蓝蛋白功能研究进展
• 1.3.1 血蓝蛋白的免疫学功能
• 1.4 本论文研究的目的与意义
• 第二章 对虾血蓝蛋白糖基多样性的初步研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 溶液配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 虾血清的制备
• 2.2.2 硫酸铵分级沉淀纯化抗体
• 2.2.3 亲和层析纯化凡纳滨对虾血蓝蛋白
• 2.2.4 Bradford法测定蛋白浓度
• 2.2.5 LHt和LH75 的SDS-PAGE分析
• 2.2.6 苯酚-硫酸法测定糖蛋白LHt和LH75 中糖含量
• 2.2.7 凝集素印迹分析
• 2.2.8 数据统计分析
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 LHt和LH75 的SDS-PAGE分析
• 2.3.2 总糖含量分析
• 2.3.3 凝集素印迹分析
• 2.4 讨论
• 第三章 两种血蓝蛋白凝集活性比较及其作用靶标的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 溶液配置
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 亲和层析纯化凡纳滨对虾血蓝蛋白
• 3.2.2 细菌悬液的制备
• 3.2.3 细菌凝集实验
• 3.2.4 细菌超声破碎液的制备
• 3.2.5 细菌外膜蛋白的制备
• 3.2.6 凝集抑制实验
• 3.2.7 大肠杆菌 K12 外膜蛋白敲除菌凝集实验
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 LHt和LH75 凝集活性比较
• 3.3.2 血蓝蛋白与病原菌凝集作用靶标的初步分析
• 3.3.3 大肠杆菌 K12 外膜蛋白敲除菌凝集实验
• 3.4 讨论
• 第四章 两种血蓝蛋白抑菌活性比较及其作用靶标的研究
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 亲和层析纯化凡纳滨对虾血蓝蛋白
• 4.2.2 抑菌实验
• 4.2.3 数据统计分析
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 LHt和LH75 抑菌活性比较
• 4.3.2 不同浓度血蓝蛋白抑菌活性比较
• 4.3.3 血蓝蛋白对不同水产致病菌抑菌活性分析
• 4.3.4 血蓝蛋白与病原菌抑菌作用靶标的初步分析
• 4.4 讨论
• 第五章 两种血蓝蛋白溶血活性比较及其作用机制的研究
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 溶液配置
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 亲和层析纯化凡纳滨对虾血蓝蛋白
• 5.2.2 红细胞悬液配制
• 5.2.3 溶血活性测定
• 5.2.4 溶血动态分析
• 5.2.5 渗透保护实验
• 5.2.6 SDS-PAGE和Western-blotting分析
• 5.2.7 SDS-PAGE胶内蛋白快速回收方法
• 5.2.8 数据统计分析
• 5.3 结果分析
• 5.3.1 血蓝蛋白溶血活性分析
• 5.3.2 血蓝蛋白溶血活性影响因素分析
• 5.3.3 血蓝蛋白溶血活性作用机制分析
• 5.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在读硕士期间发表的论文