猪链球菌全基因组测序与比较基因组学研究

论文摘要

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种重要的人兽共患病病原,广泛分布与世界各地,给养猪产业带来巨大经济损失,同时也严重威胁着人类健康。在临床上能引起猪的脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎及流产等症状,而人体猪链球菌感染呈散在分布,同时亦有大规模爆发的报道。猪链球菌可分为33个血清型（1/2,1-31,33）,2型与致病的关系最为密切,但其它血清型感染也常有发生。目前对于其毒力相关因子及感染过程中的宿主相互作用及致病机制的研究尚不够透彻,不同毒力类型的菌株间本质差异仍不清楚,同时各血清型间的相互关系及血清型多样性的遗传基础也认识不足,导致猪链球菌的预防与控制工作难以有效进行。因此,迫切需要提供猪链球菌的更全面的遗传图谱,以破译其致病相关的遗传基础,更好地进行功能研究。为了从基因组水平上研究猪链球菌的致病性、耐药性及各血清型进化关系,我们做了如下具体工作：1.对8株猪链球菌的临床分离株进行了全基因组Solexa测序、拼接、补洞及注释工作,并最终获得7株完整基因组图谱和1株草图。这8株菌中,1/2型、1型、2型、3型、7型、9型及14型各一株,另外还有一株无法分型的多耐药菌株。各菌株基因组大小从2,034,321bp到2,183,059bp不等,菌株中尚未发现质粒存在。本次所测猪链球菌各菌株中均存在一定数量的假基因及截短基因,反映了这些基因与环境适应的相关性。2.将本研究中完整测序菌株与GenBank数据库中已公布的6株2型菌株一起进行全基因组多序列比对分析,发现猪链球菌基因组中存在重排与倒位现象,根据基因组共线性情况将13株完整基因组大致上分为3类,除BM407以外所有2型菌株和1/2型及14型菌株可为一类,而BM407、D12和ST1基因组结构较相似,另外D9与ST3则共线性较好。3.将这13株菌基因组中所有编码基因提取出来并进行相互比对寻找同源基因簇,计算猪链球菌的核心基因组与泛基因组大小,并通过统计与回归的方法,预测猪链球菌核心基因数最终会达到1126,而泛基因组属于开放的类型,即使测出相当数量的菌株基因组,仍然会有新的基因加入到泛基因组中,计算出增加的新基因数量平均约为82。4.我们还用两种方法探讨了猪链球菌各血清型与进化的关系,即核心基因的多序列比对与最大似然法绘制进化树,以及从基因的得与失角度以UPGMA的方法绘制。这两种方法整体上结果一致,所有2型菌株及1/2型与14型菌株处于相近的地位,并与其它血清型明显区分,有趣的是此结果与基因组共线性较相似。5.将3株强毒株05ZYH33、98HAH33和SC84与相对较弱毒株A7进行分析,发现强毒株共有而A7中不存在基因大部分分布于之前研究所鉴定出的89K毒力岛上,进一步揭示了毒力岛的重要贡献,并且在A7中发现了89K的整合位点,表明89K毒力岛很有可能通过此位点整合到基因组上或从基因组上切割下来,从而进行基因水平转移。6.另外,本研究通过将所测的对15种抗生素耐药菌株R61（不能分型）与对这些全部敏感的2型菌株A7进行比较基因组分析,寻找到这些耐药相关的基因,并总结出3类机制,即靶点改变,外排效应及基因介导的靶点保护,同时发现,基因的水平转移对于细菌耐药性的获得有重要影响。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表（Abbreviation）
• 1 文献综述
• 1.1 微生物基因组学的研究背景
• 1.1.1 微生物基因组学的历史
• 1.1.2 微生物基因组学研究内容
• 1.1.3 微生物基因组学的应用
• 1.2 猪链球菌的生物学特性
• 1.2.1 猪链球菌的病原学特性及分型
• 1.2.2 猪链球菌流行病学研究进展
• 1.2.3 猪链球菌鉴定方法
• 1.2.4 猪链球菌致病性与毒力因子研究
• 1.2.5 猪链球菌耐药性研究进展
• 1.2.6 猪链球菌基因组学研究进展
• 1.3 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要培养基和溶液
• 2.1.3 主要药品与试剂
• 2.1.4 主要仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 细菌的分离鉴定
• 2.2.2 菌株对小鼠的毒力评价
• 2.2.3 菌株R61和A7的药物敏感性验证
• 2.2.4 细菌基因组的提取
• 2.2.5 猪链球菌全基因组测序
• 2.2.6 基因组注释
• 2.2.7 基因组序列提交
• 2.2.8 基因组学和比较基因组分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 猪链球菌菌株的基本特征
• 3.2 所测菌株基因组特性及拼接结果统计
• 3.3 基因组共线性分析
• 3.4 猪链球菌同源基因簇
• 3.5 核心基因组与泛基因组分析
• 3.5.1 核心基因组
• 3.5.2 泛基因组
• 3.6 不同血清型菌株的进化关系
• 3.7 猪链球菌荚膜合成位点
• 3.8 猪链球菌比较基因组学与耐药性研究
• 3.8.1 ARDB数据库搜索结果
• 3.8.2 耐药菌株R61中耐药机制分析
• 3.9 讨论
• 3.9.1 关于基因组测序问题
• 3.9.2 猪链球菌的泛基因组与基因水平转移
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢