太空诱变玉米核不育突变体的AFLP及生化特性分析

论文摘要

花粉及花药发育是植物发育生物学的一个重要研究领域。在高等植物的小孢子发生发育及花粉成熟过程中，涉及到大量基因的协同表达，其中某个基因的结构或表达发生变异，都将导致雄性不育。很多高等植物中都存在着雄性不育现象，对雄性不育突变体的研究，不仅有助于了解植物的生殖规律，更重要的是它具有潜在的农业应用价值，如雄性不育的利用。1996年，四川农业大学玉米研究所通过太空诱变处理川单9号种子获得了一份雄性不育突变体，经研究表明，该雄性不育突变体由一对隐性基因控制。可育株自交后代群体可育植株与不育植株分离比例为3：1，姊妹交群体可育植株与不育植株分离比例为1：1。对该材料的细胞学观察、基因定位方面的工作已经开展，但是基因组对比分析、mRNA差异表达和生理生化方面的工作还是空白。本研究以该突变体的姊妹交六代分离群体为材料，从基因组DNA、转录的CDNA和生理生化三个方面对可育和不育植株的花药进行了分析，得到的主要结果如下：1．以可育和不育植株的DNA混合池为模板，选用56对EcoRⅠ／MseⅠ引物组合进行基因组对比分析，筛选出4对有差异的引物组合，分离得到3条不育植株所特有的差异条带Zmd1-302、Zmd2-287、Zmd3-246和1条可育植株所特有的差异条带Zmd4-227，并将差异条带在ZMGDB数据库中进行同源性分析。Zmd1-302去掉接头后长度为278bp，它与1条来源于玉米第3染色体上3.04位点的克隆（AC187265）同源性为98％，与1条来源于玉米雄配子cDNA文库中的EST序列（gi33771201）同源性为89％；Zmd2-287去掉接头后长度为258bp，与1条来源于玉米第2条染色体上的克隆（AC191267）的同源性为97％；Zmd3-246去掉接头后长度为222bp，与1条来源于玉米第10条染色体上的克隆（AC1877992）的同源性为99％。2．根据ZMGDB数据库中的克隆AC187265和AC191267的碱基信息对差异条带Zmd1-302和Zmd3-287的侧翼序列进行延伸，对不育来源的3条差异条带共设计了4对特异引物进行SCAR转化，但这4对引物在8株不育单株和8株可育单株中都能扩增得到与目的片段长度相同的条带，即扩增产物不能特异地区分可育植株和不育植株，AFLP标记不能成功转化为SCAR标记。3．选用16对EcoRⅠ／MseⅠ引物组合对可育和不育植株的花药进行差异表达分析，共回收得到9条差异片段，分别命名为Z1～Z9。同源序列比对发现，Z2序列与1条Zea mays putative zinc finger序列（gi46981881）同源性为88％；Z3与查尔酮合成酶（chalcone synthase）有一定的同源性，相似性为54％；Z4序列与推断的水稻脂酰CoA脱氢酶（acyl CoA dehydrogenase）同源性为76％；Z5与推断的水稻蛋白激酶AFC3、PK12同源性较高为91％；Z8与推断的水稻甘氨酸脱羧酶的H蛋白（glycine decarboxylase，H-protein）同源性为78％。再结合半定量RT-PCR的方法，分析了Z3、Z5和Z8这3条差异条带在可育和不育植株的花药发育中的表达情况。研究发现，Z3只在可育雄穗刚抽出时表达；Z5除在可育早期不表达外，在可育的其它时期都表达，且在不育雄穗完全抽出时也表达；而另一条可育特异条带Z8则是一个上调表达的基因，在雄穗抽出2～3cm时起始表达，雄穗完全抽出时表达量达到最大。4．对可育和不育4个发育时期的花药的可溶性糖、淀粉、蛋白质和游离脯氨酸的含量分析时发现，不同发育时期可育花药中的可溶性糖、淀粉、蛋白质和游离脯氨酸的含量均高于对应时期的不育花药中的含量。其中，可育花药和不育花药的游离脯氨酸含量差异最明显，在雄穗刚开始孕穗不久其含量已有较大差异。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 1 植物花粉发育与雄性不育
• 1.1 植物花粉发育
• 1.2 植物雄性不育
• 1.2.1 植物雄性不育的来源
• 1.2.2 雄性不育的生理生化研究进展
• 1.2.3 雄性不育的基因研究进展
• 2 AFLP技术的基本原理及其在植物雄性不育研究中的应用
• 2.1 AFLP技术在植物雄性不育基因组研究中的应用
• 2.2 AFLP技术在植物雄性不育差异表达研究中的应用
• 3 立题依据
• 第二部分 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 太空诱变玉米核不育突变体DNA-AFLP分析
• 2.1.1 DNA的提取和检测
• 2.1.2 集团的构建
• 2.1.3 AFLP分析
• 2.1.4 差异片段的回收
• 2.1.5 差异片段的克隆和测序
• 2.1.6 序列比对分析
• 2.1.7 SCAR标记转化
• 2.2 太空诱变玉米核不育突变体cDNA-AFLP分析
• 2.2.1 玉米总RNA的提取
• 2.2.2 双链cDNA的合成
• 2.2.3 cDNA-AFLP分析
• 2.2.4 差异片段的回收、克隆和测序
• 2.2.5 差异片段的半定量RT-PCR分析
• 2.3 雄性不育材料可育和不育花药的生化特性分析
• 2.3.1 可溶性糖和淀粉含量的测定
• 2.3.2 可溶性蛋白质含量的测定
• 2.3.3 游离脯氨酸含量的测定
• 第三部分 结果分析
• 1 太空诱变玉米核不育突变体DNA-AFLP分析
• 1.1 DNA的检测
• 1.2 酶切和连接
• 1.3 预扩增
• 1.4 选择性扩增
• 1.5 差异片段的回收、克隆和测序
• 1.6 差异片段的序列分析
• 1.7 差异片段的SCAR转化
• 2 太空诱变玉米核不育突变体cDNA-AFLP分析
• 2.1 RNA的检测
• 2.2 预扩增
• 2.3 选择性扩增
• 2.4 差异片段的回收
• 2.5 差异片段的克隆和测序
• 2.6 差异片段同源性分析
• 2.7 差异片段的半定量RT-PCR结果
• 3 雄性不育材料可育和不育花药的生化特性分析
• 3.1 可溶性糖含量
• 3.2 淀粉含量
• 3.3 可溶性蛋白质含量
• 3.4 游离脯氨酸含量
• 第四部分 讨论
• 1 太空诱变玉米核不育突变体AFLP探讨
• 2 关于SCAR标记转化
• 3 花药物质代谢与雄性不育的关系
• 4 后续研究探讨
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文