人类载脂蛋白AⅤ与血脂和炎症因子的关系以及TNF-α下调其表达的机制初探

论文摘要

背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CHD）是导致人类死亡和病残的主要疾病之一,血循环中甘油三酯（triglyceride,TG）水平的升高是其发病的独立危险因素。载脂蛋白（apolipoprotein）是调节血脂代谢的最重要因素,尤其是Apo AⅠ/CⅢ/AⅣ基因簇与血脂代谢联系非常紧密。通过比较人类和小鼠的该基因簇序列,人们发现了一种新的载脂蛋白——载脂蛋白AⅤ（apolipoprotein AⅤ,ApoAⅤ）。目前许多研究表明,Apo AⅤ是调节血循环中TG水平的最重要因素并且还可能影响高密度脂蛋白胆固醇（high densitylipoprotein-cholesterol,HDL-C）的代谢,但这些研究多是以动物为实验对象而且得出的结论互不一致,因此应该在人类自身进行Apo AⅤ的功能研究如与血脂的关系等。机体炎症通常伴有高甘油三酯血症,这与炎症细胞因子（inflammatory cytokine）有关。炎症细胞因子如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）能刺激和调节炎症反应,而且与极低密度脂蛋白胆固醇（very low density lipoprotein,VLDL）中的胆固醇及甘油三酯呈正相关而与HDL-C负相关,其具体机制尚不清楚。炎症因子是否可影响Apo AⅤ的表达从而升高血TG水平则有待进一步研究。目的应用基因工程技术,用质粒作为人类Apo AⅤ基因载体,转化并构建大肠杆菌原核表达系统表达重组人类Apo AⅤ蛋白并进一步将之纯化。免疫小鼠产生抗人类Apo AⅤ的单克隆抗体,建立检测人类Apo AⅤ的双抗体三明治夹心ELISA方法,进而观察健康中国人群中血清npo AⅤ与血脂、炎症因子高敏C反应蛋白（high sensitive Creaction protein,Hs-CRP）及TNF-α的关系。应用TNF-α刺激HepG2细胞株构建体外炎症反应细胞模型,探讨炎症反应对HepG2细胞ApoAⅤ基因表达、蛋白合成的影响,并进一步探讨其机制是否与核转录因子-κB（nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB）活化有关。方法1.将人类Apo AⅤcDNA及载体质粒用限制性核酸内切酶切割再酶连以建立重组质粒,转化表达宿主大肠杆菌并以IPTG诱导重组蛋白表达,超声裂菌提取目的蛋白,Ni-NTA亲和层析法纯化,逐步透析法复性。2.将重组人类Apo AⅤ免疫Balb/c小鼠,提取免疫脾细胞,应用杂交瘤技术与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用HAT及HT进行选择培养,有限稀释法筛选阳性克隆以建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,注入小鼠腹腔制备腹水,亲和层析法纯化单抗,过碘酸钠法标记单克隆抗体,方阵法确定三明治双抗体夹心ELISA法的最佳实验条件。3.血清甘油三酯、总胆固醇浓度用酶法测定,HDL-C、LDL-C浓度采用化学遮蔽法直接测定;Hs-CRP用免疫透射比浊法测定;TNF-α用ELISA方法测定;应用针对不同抗原位点的抗重组npo AⅤ单克隆抗体配对,形成夹心三明治ELISA方法以检测人血清Apo AⅤ。4.体外培养HepG2细胞株,将培养的细胞分别以不同浓度的TNF-α分别作用或用相同浓度的TNF-α分别作用不同时间,或将NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨甲基甲酸盐（Pytrolidine dithiocarbanate,PDTC 50μmol/L）与TNF-α同时作用,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测npo AⅤmRNA表达,ELISA法检测NF-κB的活化,ELISA法检测细胞培养上清液中Apo AⅤ含量。结果人类npo AⅤcDNA插入pQE30质粒建立了重组质粒,转化到宿主菌诱导表达了目的蛋白,产物蛋白经亲和层析纯化后见蛋白纯度较高。重组蛋白免疫小鼠制备了两株单克隆抗体1E8、2G1,两种单抗有不同的抗原结合位点,均属于IgG1亚类。1E8的亲和常数为7.153×1010M-1,2G1的亲和常数为1.054×1011M-1。两株单克隆抗体只能检测到重组Apo AⅤ蛋白,不与其他相关抗原或无关抗原反应;两株单克隆抗体形成三明治双抗体夹心ELISA法测定健康中国人血清Apo AⅤ浓度为182.7±104.7ng/ml,其浓度与TG呈负相关（r=-0.225,P=0.031）,与HDL-C正相关（r=0.453,P＜0.001）,与体重指数负相关（r=-0.345,P=0.001）,与Hs-CRP及TNF-α在总体上呈负相关（Hs-CRP r=-0.300,P=0.004;TNF-αr=-0.424,P=0.001）。不同浓度的TNF-α作用于HepG2细胞作用不同时间,发现HepG2细胞表达npoAⅤmRNA表达下降,培养上清液中npo AⅤ含量减少,作用呈显著的剂量和时间依赖性（P＜0.01）;Apo AⅤmRNA的表达量与NF-κB的活化成反比,而PDTC可明显抑制这种作用（P＜0.01）。结论利用大肠杆菌成功表达并纯化了目的蛋白,通过免疫小鼠制备了单克隆抗体,建立了检测人类Apo AⅤ的双抗体夹心ELISA方法。人血清中载脂蛋白AⅤ含量极低,并与甘油三酯呈负相关,与高密度脂蛋白胆固醇正相关,与体重指数负相关,与炎症因子Hs-CRP及TNF-α负相关。TNF-α能下调HepG2细胞中Apo AⅤ的基因表达及蛋白合成水平,NF-κB的激活参与了此过程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 第一章 重组人类载脂蛋白AV的表达及纯化
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 抗人类载脂蛋白AV单克隆抗体的制备及其应用
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 人血清载脂蛋白AV浓度及其与血脂和炎症因子的关系
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 肿瘤坏死因子-α对载脂蛋白AV表达的调节以及核转录因子-κB在其中的作用
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 综述 载脂蛋白AV研究新进展
• 致谢
• 发表论文情况