论文摘要
目的:糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病常见并发症,是近年来引起终末期肾衰的主要原因之一,其主要病理变化为肾小球肥大,肾小球和肾小管基底膜增厚、系膜区细胞外基质（extracellular matrix, ECM）堆积,最终导致肾小球硬化伴有肾间质纤维化。糖尿病肾病的发病机制非常复杂,是多种因素综合作用的结果,而这些因素又能够引起肾脏细胞内信号转导通路发生变化。Janus kinas（eJAK）/ signal transducer and activators of transcription（STAT）介导信号途径是一条重要的信号通道。1997年以来,相继被发现的细胞因子信号负调控因子（suppressors of cytokine sigmaling, SOCS）家族,通过参与负调控多种细胞因子介导的信号通路,最终影响细胞的生长、增殖、凋亡等基本生物学行为。SOCS-1和SOCS-3在体内分布较为广泛。许多证据显示,SOCS蛋白参与了多系统多种疾病的损伤调控。在我们先前的研究中已经证实,JAK/STAT信号途径参与了糖尿病肾病的发病过程。但SOCS家族作为JAK/STAT信号途径的重要负调控因子在糖尿病肾脏及肾细胞中表达情况的研究未见报道。本研究应用糖尿病大鼠模型和体外培养人肾小球系膜细胞（HMC）/人近曲小管上皮细胞（HKC）,从整体、细胞和分子等不同水平,系统观察了糖尿病肾病早期SOCS-1、SOCS-3在肾脏的表达,及高糖（high glosuease,HG）和晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products, AGEs）作用下SOCS-1、SOCS-3在肾细胞内的表达及对JAK/STAT信号途径的抑制作用;并用细胞转染的方法建立HMC和HKC SOCS-3基因转染稳定细胞系,观察SOCS-3基因高表达状态下HG对HMC增殖、凋亡、细胞外基质的产生以及AGEs对HKC转分化的影响,以进一步探讨SOCS-3基因在HG和AGEs影响下肾细胞信号转导的抑制作用以及对肾细胞损伤的影响,以期为进一步阐明糖尿病肾病发病的分子机制及其防治提供一条新的思路。方法:1大鼠糖尿病模型的制备和SOCS-1、SOCS-3蛋白及mRNA的检测Wistar雄性大鼠随机分为正常对照组和糖尿病组,DM组大鼠腹腔单次注射链脲佐菌素65mg/kg（STZ溶于0.1mol/L枸橼酸盐缓冲液中,pH值4.5）,对照组只注射相同体积的枸橼酸盐缓冲液,48h后测定血糖和尿糖,血糖值≥16.7mmol/L,尿糖值+++++++者确定为DM模型。分别于成模后1、2、4、8、12周每组取5只大鼠,切取肾脏。取部分肾皮质组织置于4%多聚甲醛或2%戊二醛固定用于光镜、电镜观察及免疫组织化学染色法检测SOCS-1、SOCS-3蛋白的表达;取部分肾皮质组织提取总蛋白,Western blot检测SOCS-1、SOCS-3、P-JAK2、P-STAT1蛋白表达;取部分肾皮质组织提取总RNA,半定量RT-PCR检测SOCS-1 mRNA和SOCS-3mRNA表达。2高糖培养下HMC中SOCS-1、SOCS-3蛋白及mRNA的检测体外培养HMC,无血清RP-1640培养基同步培养24h,细胞分别分成3组:NG组（5.5mmol/L葡萄糖）;HG组（30mmol/L葡萄糖）;HG+AG490组（H+A）。分别在6孔板和25 cm2塑料培养瓶内培养,培养12、24、48h倒置显微镜观察细胞形态学改变;培养48h收集细胞2%戊二醛固定用于电镜观察细胞超微结构改变;培养2、4、6、12、24、48h分别收集细胞提取细胞总蛋白、RNA。采用免疫细胞化学和Western blot检测SOCS-1、SOCS-3蛋白的表达;Western blot检测P-JAK2、P-STAT1蛋白的表达;半定量RT-PCR检测细胞SOCS-1 mRNA和SOCS-3mRNA的水平。3 AGEs培养下HKC中SOCS-1、SOCS-3蛋白及mRNA的检测体外培养HKC,无血清DMEM培养基同步培养24h,细胞分别分成3组: CG组（50ug/mL BSA）;AGEs组（50ug/mLAGEs-BSA）;AGEs+AG490组（A+A）。分别在6孔板和25 cm2塑料培养瓶内培养,培养12、24、48h倒置显微镜观察细胞形态学改变;培养48h收集细胞2%戊二醛固定用于电镜观察细胞超微结构改变;培养2、4、6、12、24、48h分别收集细胞提取细胞总蛋白、RNA。采用流式细胞仪、免疫细胞化学和Western blot检测SOCS-1、SOCS-3蛋白的表达;Western blot检测p-JAK2、p-STAT1蛋白的表达;半定量RT-PCR检测细胞SOCS-1mRNA和SOCS-3mRNA的水平。4 HG培养下SOCS-3基因转染HMC细胞增殖、细胞凋亡及TGF-β、细胞外基质FN蛋白的检测应用lipofectamine 2000转染试剂将PCR3.1 SOCS-3真核表达载体转染入HMC,经G418筛选,建立HMC SOCS-3基因转染稳定细胞系,分成4组:高糖+ PCR3.1 SOCS-3转染组（30mmol/L glucose, HG+PS）;高糖+ PCR3.1-Vector空质粒转染组（30mmol/L glucose, HG+PV）;高糖组（30mmol/L glucose, HG）;空白对照组（未转染的亲本细胞5.5mmol/L glucose, CG）。12、24、48h收集细胞,倒置显微镜观察转染前后及高糖作用下细胞形态学变化;免疫细胞化学检测在高糖作用下SOCS-3基因转染HMC细胞增殖活性（PI）;Western blot检测细胞P-JAK2、P-STAT1及细胞上清TGF-β、FN蛋白的表达;DeadEndTM Colorimetric TUNEL System试剂盒检测HMC在高糖作用下细胞凋亡指数（AI）。5 AGEs培养下SOCS-3基因转染HKCα-SMA、TGF-β、FN蛋白的检测应用lipofectamine 2000转染试剂将PCR3.1 SOCS-3真核表达载体转染入HKC,经G418筛选,建立HKC SOCS-3基因转染稳定细胞系,分成4组:AGEs+PCR3.1-SOCS-3转染组（50ug/ml, A+S）; AGEs + PCR3.1-Vector空质粒转染对照组（50ug/ml, A+V）;AGEs（50ug/mL）组;正常对照组（未经转染亲本HKC细胞control group, CG）。12、24、48h收集细胞,倒置显微镜观察转染前后及AGEs作用下HKC细胞形态学变化;免疫细胞化学检测SOCS-3基因转染HKC在AGEs作用下α-SMA的表达;Western-blot检测SOCS-3基因转染HKC在AGEs作用下p-JAK2、p-STAT1、TGF-β、FN的表达。结果:1糖尿病大鼠肾小球形态学改变及SOCS-1、SOCS-3蛋白和mRNA的表达①光镜下观察,糖尿病组1、2周肾小球均未见明显病变,4周始肾小球体积增大,8-12周系膜基质轻度增多,肾小管上皮细胞出现空泡变性,小灶状萎缩,小动脉管壁轻度增厚。电镜观察糖尿病组12周改变,肾小球基底膜增厚明显,足细胞足突广泛融合,系膜基质增多;近曲小管上皮细胞游离面微绒毛减少或消失,细胞内出现大小不等的空泡等。②免疫组化显示SOCS-1、SOCS-3蛋白在对照组和糖尿病组大鼠肾小球均有表达,表达部位主要在肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞胞浆内,在正常对照组SOCS-1表达较弱,在糖尿病组表达明显增强。③Western blot结果显示SOCS-1、SOCS-3蛋白在糖尿病1、2、4、8周时表达均增加,SOCS-1在2w时达高峰,SOCS-3在4w达高峰（P <0.01）;糖尿病第1w起,肾小球p-STAT1蛋白水平表达开始增加,并且随时间延长增高更加明显。在糖尿病第2w时表达水平最高,4、8、12w时表达水平有所下降,但仍明显高于对照组。P-JAK2表达自1w起高于对照组,随时间延长增高更加明显。④半定量RT-PCR结果显示,SOCS-1 mRNA和SOCS-3 mRNA在对照组有少量基础表达。与对照组相比,糖尿病第1w SOCS-1 mRNA和SOCS-3 mRNA表达就开始上调, SOCS-1 mRNA于2w表达最高,SOCS-3 mRNA于第4w表达最高以后逐渐回落,但仍高于对照组。2 HG培养下HMC细胞形态学改变及SOCS-1、SOCS-3蛋白和mRNA的表达①倒置显微镜（inversion microscope）观察HG刺激下HMC细胞形态学改变,与对照组比,细胞逐渐变梭,有的单个细胞变圆,细胞突起变短、减少,并出现不规则突起;胞质内出现较多颗粒及空泡。透射电镜观察与正常对照组相比,HG诱导下,HMC细胞核增大、扭曲,细胞内线粒体明显减少,部分嵴消失,粗面内质网明显增加,细胞内有大小不等的溶酶体及空泡。②免疫细胞化学显示,SOCS-1、SOCS-3蛋白在HMC细胞浆和胞核均有表达,SOCS-1表达较弱,SOCS-3以胞浆表达为主,伴有不同程度的胞核表达。与正常对照组比较,HG组HMC SOCS-1、SOCS-3胞浆表达均增强,Western blot显示SOCS-1在HG刺激4h表达最强,SOCS-3在HG刺激6h表达最强。③Western blot显示,与对照组相比,HG刺激24h时JAK2和STAT1磷酸化明显增强（P<0.01）, AG490处理组HMC P-STAT1的表达明显降低。H+A处理组JAK2、STAT1磷酸化以及SOCS-1、SOCS-3表达明显被抑制（P<0.05）。④RT-PCR结果显示SOCS-3 mRNA在正常HMC中有表达,HG诱导下表达上调,差异有显著性意义（P<0.01）,其中6h表达上调显著。SOCS-1 mRNA在正常HMC有弱表达,HG诱导下表达上调,差异有显著性意义（P<0.01）,其中4h表达上调显著。AG490处理组H+A与同时期HG组相比表达有所下调（P<0.05）,但仍高于正常对照组（P<0.05）。3 AGEs培养下HKC细胞形态学改变及SOCS-1、SOCS-3蛋白和mRNA中的表达①倒置显微镜（inversion microscope）观察AGEs刺激组,细胞变梭,有的单个细胞变圆,核固缩,细胞突起变短、减少,胞质内出现较多颗粒及空泡,且随着作用时间延长细胞界限不清而胞质内颗粒增多。透射电镜观察与正常对照组相比, AGEs刺激下HKC细胞表面微绒毛及细胞内线粒体明显减少,部分嵴消失,粗面内质网明显增加,并出现脱颗粒,细胞内有大小不等的溶酶体及空泡。②免疫细胞化学显示,SOCS-1、SOCS-3蛋白在人肾小管上皮细胞（HKC）细胞浆和胞核均有表达,SOCS-1表达较弱,SOCS-3以胞浆表达为主,伴有不同程度的胞核表达。流式细胞仪检测显示,与正常对照组比较, AGEs组HKC SOCS-1、SOCS-3胞浆表达均增强,其中SOCS-1在AGEs刺激12h表达最强（P<0.01）,SOCS-3在AGEs刺激24h表达最强（P<0.01）。③Western blot显示AG490处理组HKC P-STAT1的表达明显降低。与对照组相比, AGEs刺激24h时JAK2磷酸化明显增强（P<0.01）。AG490处理组A+A与同时期AGEs组相比表达有所下调（P<0.05）,但仍高于正常对照组（P<0.05）。④RT-PCR结果显示SOCS-3 mRNA在正常HKC中有表达,AGEs诱导下表达上调,差异有显著性意义（P<0.01）,其中12h表达上调显著。SOCS-1 mRNA在正常HKC有弱表达, AGEs诱导下表达上调,差异有显著性意义（P<0.01）,其中6h表达显著上调。AG490处理组A+A与同时期AGEs组相比表达有所下调（P<0.05）,但仍高于正常对照组（P<0.05）。4质粒的转化、提取、鉴定及SOCS-3基因转染HMC、HKC的筛选①PCR3.1-SOCS-3质粒经DH5a感受态菌的制备转入细菌并大量扩增,中量提取的质粒经0.8%琼脂糖凝胶电泳,结果显示和标准质粒电泳图谱,条带相符。②免疫细胞化学结果显示:SOCS-3基因转染HMC/HKC实验组可见大多数细胞胞浆内棕黄色阳性颗粒;而对照组和空白组仅有少量细胞胞浆内出现少量棕黄色颗粒,表明SOCS-3基因成功导入HMC及HKC,并在蛋白水平获得高效表达。③RT-PCR结果显示: HMC及HKC转染实验组SOCS-3 mRNA的表达量明显高于对照组和空白组,表明SOCS-3基因成功导入HMC及HKC。5 HG对SOCS-3基因转染HMC细胞增殖和凋亡以及细胞外基质的影响①倒置显微镜下观察,质粒转染的细胞HG+PS组、HG+PV组及未转染HG组与正常CG组细胞相比,细胞均为梭形,并出现多边形,细胞突起变短,仍呈平行或放射状生长方式,胞浆内颗粒和空泡增加。②免疫细胞化学结果显示:PCNA在HMC增殖细胞中细胞核呈棕黄色颗粒。与正常对照CG相比,HG+PS组在高糖作用下PCNA细胞阳性指数（PI=35.87±4.96）明显增高,但增高幅度低于HG+PV组（PI=68.24±8.34）与HG组（PI=61.07±9.34）。③Western blot显示在高糖刺激12、24、48h下,与CG组相比,转染SOCS-3基因的HG+PS组P-JAK2、P-STAT1蛋白表达趋势与HG+PV组与HG组一致,均明显增高,各时相点无显著差异,较同期HG+PV组与HG组相比明显降低（P<0.05）,HG+PV组与HG组组间无明显差异;在高糖刺激48h的HMC上清液中HG+PS组及HG+PV组、HG组与CG组相比TGF-β和FN分泌均增加,差异有统计学意义（P<0.01）,HG+PS组增高幅度低于HG+PV组与HG组,HG+PV组与HG组组间无明显差异。④TUNEL法检测结果特异地显示凋亡细胞为棕黄色,其他复染细胞核为蓝色,且对比明显。SOCS-3转染细胞HG+PS组在高糖刺激48h细胞凋亡指数（AI=11.87±1.96）明显增高,增高幅度低于HG+PV组、HG组（AI=15.24±4.34、AI=13.93±5.34）,与CG组相比差异有统计学意义（P<0.05）,但组间无显著性差异。6 AGEs对SOCS-3基因转染HKC转分化的影响①倒置显微镜下观察AGEs刺激48h ,质粒转染的HKC细胞A+S组、A+V组及AGEs组细胞与CG组相比,细胞更为梭形,并出现多边形,细胞突起变短,仍呈平行或放射状生长方式,胞浆内颗粒和空泡增加。②免疫细胞化学检测SOCS-3转染HKC在AGEs刺激48hα-SMA在HKC细胞浆呈棕黄色颗粒。与正常对照BSA相比,A+S组、A+V组在AGEs刺激下α-SMA表达明显增高（P<0.05）,但A+S组增高幅度低于A+V组（P<0.05）。③Western-blot检测结果:AGEs刺激12、24、48h,与CG组相比,转染SOCS-3基因A+S和A+V组与AGEs组p-JAK2、p-STAT1蛋白表达趋势基本一致,明显增高（P均<0.05）,但A+S组p- JAK2、p-STAT1较同期A+V组与AGEs组相比明显降低（P<0.05）各时相点无显著差异。A+V组与AGEs组组间无明显差异; AGEs刺激48h,SOCS-3转染HKC A+S组及A+V组、AGEs组与CG组相比,TGF-β和FN表达均增加,差异有统计学意义（P<0.05,P<0.01）,A+S组增高幅度低于A+V组与AGEs组,A+V组与AGEs组组间无明显差异。结论:①SOCS-1、SOCS-3在正常大鼠和体外培养人系膜细胞（HMC）和人近曲小管上皮细胞中mRNA及蛋白水平均有基础表达,SOCS-1表达较弱,表达主要定位在细胞胞浆,少量胞核;②糖尿病早期肾小球SOCS-1、SOCS-3mRNA及蛋白水平表达明显上调。HG/AGES能够诱导体外培养HMC/HKC SOCS-1、SOCS-3表达增强,并可能是通过JAK/STAT信号途径的激活,使信号蛋白JAK2和STAT1的磷酸化增强。JAK2特异性抑制剂AG490能够降低HG/AGES刺激抑制STAT1的磷酸化,并同时下调SOCS-1、SOCS-3 mRNA的表达,提示SOCS家族通过对JAK/STAT信号途径进行负反馈调节参与糖尿病肾病的发病过程。③利用脂质体成功将PCR3.1SOCS-3表达载体转染至HMC/HKC,并经G418（600ug/ml）筛选后获得稳定细胞系,RT-PCR和免疫细胞化学法证实SOCS-3基因在转染细胞内获得高效表达。④HG能够诱导STAT1表达和活化,促进HMC的增殖和凋亡及TGF-β、FN的产生, SOCS-3基因可能通过阻止STAT1蛋白磷酸化而抑制HG诱导的HMC增殖以及细胞外基质FN的产生。⑤AGEs能够诱导STAT1表达和活化,促进HKCα-SMA、TGF-β及FN的表达,促进HKC转分化,SOCS-3高表达能够抑制HKCα-SMA、TGF-β及FN的表达。SOCS-3基因可能通过对JAK/STAT信号途径的负反馈作用而抑制AGEs诱导的HKC转分化,从而发挥其对HKC的保护作用。
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