论文摘要
RNA残留量是质粒DNA作为基因疫苗主要载体的重要质量评价指标,但因RNA在细胞内的含量极高及在组成、性质上与DNA相似而难以从DNA/RNA混合物中脱除。用传统的色谱分离法和RNA酶降解法虽可去除RNA,达到纯化DNA的目的,但前者操作复杂,后者造价高昂并易带来二次污染。虽然磁分离法具有操作简便、快速、无二次污染等诸多优势而广泛用于DNA的直接纯化,但迄今没有用该法从DNA/RNA混合物中选择性去除RNA,以纯化DNA的报道。本研究合成了Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子,以其为固相载体并基于固定化金属亲和层析原理,成功实现了DNA/RNA混合物中RNA的选择性脱除和pDNA的选择性纯化,为医用pDNA纯化提供了理论依据和新思路。其主要研究工作及结果如下：1.以FeCl3·6H2O, FeCl2·4H2O和NH3H2O为原料,采用化学共沉淀法合成了Fe304磁性纳米粒子,并对其进行了柠檬酸化修饰；以其为种子,盐酸羟胺为还原剂,还原Au3+包覆在Fe304表面。结果表明：经柠檬酸钠修饰的Fe304磁性纳米粒子稳定性大为提高,在室温条件下放置数月无聚沉现象;VSM测得其饱和磁化强度为52.53emu/g,具有超顺磁性；Fe3O4@Au磁性纳米粒子外观呈红褐色,且经盐酸纯化后的Fe3O4@Au在540nm处有一个较强的Au的特征吸收峰,结合FTIR和XPS等分析,充分证明了Au对Fe304磁性纳米粒子的成功包覆;TEM分析显示Fe3O4@Au粒径约为40nm,VSM表明其饱和磁化强度为19.30emu/g,仍具有超顺磁性、较强的磁响应性和较好的分散性。2.以赖氨酸为原料,通过4步有机合成反应合成了NTA的衍生物Lys-NTA。该有机分子可通过NTA螯合过渡金属离子（如Zn2+）,也可通过游离氨基连接其他基团。以硫辛酸（TA）为连接臂,其一端通过S-Au化学键连接于Fe3O4@Au表面,另一端羧基通过缩肽反应（NHS/EDC介导）偶联Lys-NTA-Zn2+,制得Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子。FTIR、1HNMR和MS鉴定表明,通过4步有机合成反应得到了螯合配体Lys-NTA。Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+的FTIR、XPS等分析证明,Lys-NTA-Zn2+成功偶联于Fe3O4@Au表面。UV-Vis检测发现Au的特征吸收峰红移至562nm。产物具有良好的磁响应性和分散性。3.以Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+为固相吸附剂,考察了吸附时间、磷酸根浓度、pH,NaCl浓度等因素对质粒DNA纯化的影响。结果表明：在0～2mol/L范围内,NaCl浓度越高,越有利于Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子对RNA的吸附；酸性环境（如pH5.8）有利于吸附,碱性条件（pH>7.5）抑制吸附；在高浓度磷酸根（如100mmol/L）中,Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子几乎不吸附核酸；而当磷酸根浓度较低（如0.25mmol/L）时,Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子既吸附RNA也吸附pDNA。当磷酸缓冲液浓度为0.5mmol/L, pH5.8, NaCl浓度为1.5mol/L,裂解液稀释60倍时,Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子能大量地选择性吸附RNA,不吸附pDNA,达到了实验目的,使得pDNA得以纯化。
论文目录
中文摘要ABSTRACT符号说明第一章 文献综述1.1 引言1.2 复合磁性纳米粒子1.2.1 磁性纳米粒子1.2.2 磁性纳米粒子的表面修饰3O4@Au磁性复合纳米粒子'>1.2.3 Fe3O4@Au磁性复合纳米粒子1.3 固定化金属亲和层析（IMAC）1.4 固定化金属亲和磁性纳米粒子（IMAN）1.5 质粒DNA纯化现状1.6 本研究的目的意义3O4@Au的合成及表征'>第二章 Fe3O4@Au的合成及表征2.1 引言2.2 材料与方法2.2.1 实验材料及仪器设备3O4磁性纳米粒子的合成及表面修饰'>2.2.2 Fe3O4磁性纳米粒子的合成及表面修饰3O4@Au磁性纳米粒子的合成'>2.2.3 Fe3O4@Au磁性纳米粒子的合成3O4@Au磁性纳米粒子的纯化'>2.2.4 Fe3O4@Au磁性纳米粒子的纯化2.2.5 磁性纳米粒子的表征2.3 结果与讨论2.3.1 磁性纳米粒子的表观鉴定2.3.2 透射电镜分析2.3.3 紫外-可见光谱分析2.3.4 红外光谱分析2.3.5 X射线光电子能谱分析2.3.6 磁性能分析2.4 本章小结3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子的合成及表征'>第二章 Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子的合成及表征3.1 引言3.2 材料与方法3.2.1 实验材料及仪器设备3.2.2 重要试剂配制及试剂前处理ε-苄氧羰基-L-赖氨酸的合成'>3.2.3 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸的合成ε-苄氧羰基-L-赖氨酸叔丁酯的合成'>3.2.4 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸叔丁酯的合成ε-苄氧羰基-L-赖氨酸氨基三乙酸叔丁酯的合成'>3.2.5 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸氨基三乙酸叔丁酯的合成ε-苄氧羰基-L-赖氨酸氨基三乙酸的合成'>3.2.6 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸氨基三乙酸的合成3O4@Au-TA磁性纳米粒子的合成'>3.2.7 Fe3O4@Au-TA磁性纳米粒子的合成2+的合成'>3.2.8 Lys-NTA-Zn2+的合成3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子的合成'>3.2.9 Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子的合成3.2.10 表征方法3.3 结果与讨论ε-苄氧羰基-L-赖氨酸的合成结果'>3.3.1 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸的合成结果ε-苄氧羰基-L-赖氨酸叔丁酯的合成结果'>3.3.2 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸叔丁酯的合成结果ε-苄氧羰基-L-赖氨酸氨基三乙酸叔丁酯的合成结果'>3.3.3 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸氨基三乙酸叔丁酯的合成结果ε-苄氧羰基-L-赖氨酸氨基三乙酸的合成结果'>3.3.4 Nε-苄氧羰基-L-赖氨酸氨基三乙酸的合成结果3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子的表观形态'>3.3.5 Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+磁性纳米粒子的表观形态3.3.6 紫外-可见光谱分析3.3.7 红外光谱分析3.3.8 X射线光电子能谱分析3.4 本章小结3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs在pDNA分离纯化的应用'>第四章 Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs在pDNA分离纯化的应用4.1 引言4.2 材料与方法4.2.1 实验材料及仪器设备4.2.2 重要试剂配制方法4.2.3 细菌培养4.2.4 菌体裂解液的大量制备4.2.5 咪唑浓度对洗脱的影响4.2.6 NaCl浓度对洗脱的影响3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响'>4.2.7 时间对Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响'>4.2.8 NaCl浓度对Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响'>4.2.9 pH对Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响'>4.2.10 磷酸根浓度对Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响'>4.2.11 裂解液浓度对Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响4.2.12 质粒DNA酶切鉴定4.3 结果与讨论4.3.1 咪唑浓度对洗脱的影响4.3.2 NaCl浓度对洗脱的影响3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响'>4.3.3 时间对Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响'>4.3.4 NaCl浓度对Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响'>4.3.5 pH对Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响'>4.3.6 磷酸根浓度对Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响'>4.3.7 裂解液浓度对Fe3O4@Au-TA-NTA-Zn2+MNPs吸附的影响4.3.8 质粒DNA酶切鉴定4.4 本章小结全文总结创新点参考文献致谢附录1HNMR图谱'>附录1 Z-Lys 1HNMR图谱附录2 Z-Lys MS图谱1HNMR图谱'>附录3 Z-Lys（OtBu）1HNMR图谱1HNMR图谱'>附录4 Z-Lys（OtBu）1HNMR图谱1HNMR图谱'>附录5 Z-Lys（OtBu）1HNMR图谱附录6 Z-Lys（OtBu）MS图谱1HNMR图谱'>附录7 Z-Lys-NTA-（OtBu）1HNMR图谱附录8 Z-Lys-NTA-（OtBu）MS图谱1HNMR图谱'>附录9 Lys-NTA 1HNMR图谱1HNMR图谱'>附录10 Lys-NTA 1HNMR图谱附录11 Lys-NTA MS图谱攻读硕士学位期间发表的论文
相关论文文献
标签：磁性纳米粒子论文; 固定化金属亲和吸附论文;
固定化金属亲和磁性纳米粒子的合成及其在质粒DNA纯化中的应用
下载Doc文档