芥子气全身中毒小鼠血浆蛋白质组和代谢组学的初步研究

论文摘要

芥子气（Sulfur Mustard,SM）是糜烂性化学战剂的代表,其作用机理复杂,确切的中毒机制至今仍不十分清楚,尚无特效抗毒药。芥子气能够通过多种途径造成损伤,且各种途径之间也能够相互影响,因此仅针对某些环节或某一个基因、蛋白的变化开展研究,难以整体和系统地反映芥子气的损伤机理。蛋白质组学（proteomics）和代谢组学（metabonomics）是系统生物学的重要组成部分,具有整体性、系统性和全局性的特点,为芥子气复杂损伤机理的研究提供了良好的技术平台和崭新的切入点。本课题以系统生物学理论为指导,应用传统药理学方法结合蛋白质组学、代谢组学技术,开展了芥子气损伤机理和防治药物靶标的初步研究。采用传统药理学研究方法观察了芥子气全身中毒不同时间点动物整体状态、骨髓造血系统和免疫系统的动态变化情况;同时,应用基于核磁共振的代谢组学技术和基于液体芯片飞行时间质谱的蛋白质组学技术,建立了芥子气损伤过程中模型动物的代谢物谱和血浆多肽谱,获得了一组与芥子气损伤密切相关的代谢物和蛋白质。本研究为揭示芥子气中毒机理的研究提供了新的线索,为芥子气损伤相关分子的发现及抗芥子气损伤药物作用靶标的研究提供了一定的实验基础。一、芥子气全身中毒模型的建立采用低（10 mg/kg）、中（15 mg/kg）、高（20 mg/kg）三个染毒剂量摸索最适合建立模型的芥子气染毒剂量,每日检测血常规,在染毒第三天及第七天分别处死每组3只动物进行骨髓细胞凝胶电泳,连续观察7天,综合各项指标确定最适合的染毒剂量。1.芥子气不同染毒剂量对小鼠一般状态的影响三个剂量芥子气染毒组小鼠的精神、食欲、体重均有不同程度下降,染毒第三天与丙二醇对照组相比,高剂量（20 mg/kg）染毒组体重下降最为明显（P<0.01）。2.芥子气不同染毒剂量对小鼠外周血常规的影响应用血常规检测仪检测不同芥子气染毒剂量组小鼠血常规的动态变化,结果显示,与丙二醇对照组相比,三个剂量芥子气染毒组动物的红细胞、白细胞、血小板计数于染毒后第一天开始下降,至染毒第三天降至最低。其中20 mg/kg染毒组与丙二醇对照组比较,降低程度最为明显（P<0.01）,至实验结束（染毒第7天）仍旧显著低于丙二醇对照组。3.芥子气不同染毒剂量对小鼠骨髓细胞DNA的影响染毒第3天,三个剂量芥子气染毒组动物均出现了骨髓细胞DNA的损伤,以20 mg/kg染毒组损伤最严重;染毒后168 h,10 mg/kg和15 mg/kg染毒组与丙二醇对照组相比已无明显差异,而20 mg/kg染毒组仍有部分细胞存在DNA损伤。上述研究结果显示,20 mg/kg的染毒剂量能够较好地反映出芥子气中毒的损伤状态,提示以此剂量建立芥子气全身中毒模型较为合适。二、芥子气全身中毒对小鼠骨髓造血系统和免疫系统的影响1.芥子气全身中毒对小鼠骨髓造血系统的影响染毒24 h,芥子气染毒组小鼠开始出现骨髓细胞损伤,染毒72 h损伤达到高峰,染毒168 h染毒组小鼠骨髓迁移度及迁移率有所降低,但仍显著高于丙二醇对照组（P<0.01）。血常规检测结果显示,在染毒后24 h芥子气染毒组白细胞、血小板计数均显著低于丙二醇对照组（P<0.05）,红细胞计数无显著性差异;染毒72 h,三种细胞计数降至最低;染毒168 h,芥子气染毒组红细胞、白细胞、血小板计数有所回升,但仍显著低于丙二醇对照组（P<0.05）。2.芥子气全身中毒对小鼠免疫系统的影响2.1芥子气全身中毒小鼠脾脏重量和系数的动态变化染毒4 h,芥子气染毒组小鼠脾脏重量和系数即开始下降,至染毒72 h降至最低,染毒168 h时基本恢复。2.2芥子气全身中毒小鼠脾脏淋巴细胞凋亡和坏死的动态变化流式细胞仪检测结果表明,芥子气染毒组小鼠脾脏淋巴细胞凋亡比例在4 h时与丙二醇对照组相比无显著差异,24 h时达到高峰（P<0.01）,72 h有所下降,但与丙二醇对照组相比仍具有显著性差异（P<0.05）,至染毒第168h与丙二醇对照组比较已无显著差异。芥子气染毒组动物脾脏淋巴细胞坏死的比例在染毒后4个时间点均显著高于丙二醇对照组（P<0.01）,且坏死比例随染毒时间的推移逐渐下降。2.3芥子气全身中毒小鼠脾细胞增殖能力的动态变化脾细胞转化增殖实验结果显示,芥子气染毒后,模型动物脾细胞原发增殖能力、ConA及LPS诱导的T、B细胞增殖能力发生紊乱。模型动物脾细胞原发增殖能力在4个时间点均显著低于丙二醇对照组（P<0.05）;脾脏T细胞增殖能力在染毒后4 h、72 h及168 h均显著低于丙二醇对照组（P<0.01）,但在24 h则显著高于丙二醇对照组（P<0.01）;模型动物脾脏B细胞增殖能力在4 h及72 h显著低于丙二醇对照组（P<0.01）,而24 h及168 h则显著高于丙二醇对照组（P<0.05）。2.4芥子气全身中毒小鼠脾脏CD4+、CD8+ T细胞比例的动态变化流式细胞仪检测结果显示,染毒后24 h、72 h及168 h模型动物脾脏CD4+T细胞百分比均显著高于丙二醇对照组（P<0.01）;CD8+T淋巴细胞百分比在染毒后72 h显著高于丙二醇对照组（P<0.01）;CD4+/CD8+细胞比例在染毒后72 h和168 h显著高于丙二醇对照组（P<0.01）。2.5芥子气全身中毒小鼠血浆中细胞因子的动态变化应用Luminex液相芯片技术检测了小鼠血浆中IL-1β,IL-6,IL-10和TNF-α4种细胞因子水平的动态变化。结果显示,芥子气染毒小鼠血浆中IL-1β水平在染毒后24 h显著高于丙二醇对照组（P<0.05）,染毒72 h升至最高,染毒4h和168 h与丙二醇对照组比较无显著差异;IL-6水平在4、24和72 h均高于丙二醇对照组（P<0.05）,且随染毒时间推移逐渐下降;IL-10水平在染毒24 h和72 h显著低于丙二醇对照组（P<0.05）,染毒168 h恢复至丙二醇对照组水平;TNF-α水平在染毒72 h、168 h显著高于丙二醇对照组（P<0.05）,且随染毒时间推移持续上升。三、芥子气全身中毒小鼠血浆代谢物和蛋白质的研究1.芥子气全身中毒对小鼠血浆代谢物的影响应用核磁共振技术观察芥子气全身中毒对小鼠血浆代谢物的影响。结果表明,在染毒后4 h、24 h、72 h和168 h,芥子气全身中毒小鼠与对照组小鼠血浆代谢物谱明显不同,染毒后4h观察到8种差异代谢物,染毒后24h观察到10种差异代谢物,染毒后72h观察到13种差异代谢物,染毒后168h观察到6种差异代谢物。在这些代谢物中有10种代谢物随芥子气染毒时间的推移存在时间依赖性变化,分别为磷脂酰胆碱、甘油磷脂酰胆碱、3-羟基丁酸、甘油、乳酸、脂质、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白,提示这些代谢物可能与芥子气中毒密切相关。2.芥子气全身中毒对小鼠血浆蛋白质的影响应用液体芯片飞行时间质谱技术观察了芥子气全身中毒对小鼠血浆蛋白质的影响。结果表明,在芥子气染毒后4 h、24 h、72 h和168 h,芥子气全身中毒小鼠与对照组小鼠血浆多肽谱谱图明显不同。分别在芥子气染毒后4 h观察到4种、染毒24 h观察到5种、染毒72 h观察到4种、染毒168 h观察到6种差异蛋白,其中质荷比分别为2000.45、1960.83、1969.07、1980.52、2794.32、8120.8的6个蛋白在芥子气染毒过程中具有显著时间依赖性变化,提示这些蛋白质可能与芥子气中毒密切相关。通过以上研究,本论文得到以下结论:（1）芥子气全身中毒小鼠存在造血系统的损伤,且骨髓细胞DNA损伤与血常规的变化规律一致,均在染毒后24 h开始下降,至染毒72 h降至最低;（2）芥子气全身中毒小鼠存在免疫功能的紊乱和细胞因子网络的失衡,主要表现为脾脏淋巴细胞凋亡和坏死比例、T、B细胞增殖能力、CD4+/CD8+T细胞比例以及血浆中多种细胞因子水平的异常或紊乱;（3）芥子气全身中毒后小鼠血浆中有15种代谢物的水平发生了显著变化,其中10种代谢物随芥子气染毒时间的推移存在时间依赖性变化,涉及糖代谢、能量代谢、脂代谢和氧化应激等代谢途径;（4）芥子气全身中毒后小鼠血浆中有17种蛋白质的水平发生了显著变化,其中6种蛋白质随芥子气染毒过程存在显著时间依赖性变化,这些代谢物和蛋白可能与芥子气中毒密切相关。上述研究为揭示芥子气中毒机理提供了新的线索,为芥子气损伤相关分子的发现及抗芥子气损伤药物作用靶标的研究奠定了一定的实验基础。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• 三、统计学处理
• 实验结果
• 一、芥子气全身中毒模型的建立
• 1. 芥子气不同染毒剂量对小鼠体重及一般状态的影响
• 2. 芥子气不同染毒剂量对小鼠外周血常规的影响
• 3. 芥子气不同染毒剂量对小鼠骨髓细胞DNA 的损伤
• 3.1 芥子气染毒第3 天对小鼠骨髓细胞DNA 的损伤
• 3.2 芥子气染毒第7 天对小鼠骨髓细胞DNA 的损伤
• 二、芥子气全身中毒对小鼠骨髓造血系统和免疫系统的影响
• 1. 芥子气全身中毒对小鼠骨髓造血系统的影响
• 1.1 芥子气全身中毒小鼠骨髓细胞DNA 损伤的动态变化
• 1.2 芥子气全身中毒小鼠外周血常规的动态变化
• 2. 芥子气全身中毒对小鼠免疫系统的影响
• 2.1 芥子气全身中毒小鼠脾脏重量和系数的动态变化
• 2.2 芥子气全身中毒小鼠脾脏淋巴细胞凋亡和坏死的动态变化
• 2.3 芥子气全身中毒小鼠脾细胞增殖能力的动态变化
• 2.4 芥子气全身中毒小鼠脾脏CD4+、CD8+T 细胞比例动态变化
• 2.5 芥子气全身中毒小鼠血浆中细胞因子的动态变化
• 三、芥子气全身中毒小鼠血浆代谢物和蛋白质的研究
• 1. 芥子气全身中毒对小鼠血浆代谢物的影响
• 1.1 芥子气染毒后4 h 小鼠血浆代谢物的变化
• 1.2 芥子气染毒后24 h 小鼠血浆代谢物的变化
• 1.3 芥子气染毒后72 h 小鼠血浆代谢物的变化
• 1.4 芥子气染毒后168 h 小鼠血浆代谢物的变化
• 1.5 芥子气染毒过程中小鼠血浆代谢物的动态变化
• 2. 芥子气全身中毒对小鼠血浆蛋白质的影响
• 2.1 芥子气染毒后4 h 小鼠血浆蛋白质的变化
• 2.2 芥子气染毒后24 h 小鼠血浆蛋白质的变化
• 2.3 芥子气染毒后72 h 小鼠血浆蛋白质的变化
• 2.4 芥子气染毒后168 h 小鼠血浆蛋白质的变化
• 2.5 芥子气染毒过程中血浆蛋白质的动态变化
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 代表性论著
• 个人简历
• 致谢