论文摘要
慢性乙肝病毒（HBV）的感染是个全球性的健康卫生问题,世界卫生组织（WHO）统计全球有近4亿人为慢性乙肝病毒携带者,许多慢性HBV感染者最终发生严重的肝脏疾病包括慢性肝炎、肝硬变和肝细胞肝癌,这些疾病每年导致约近一百万人死亡。APOBEC3s具有针对多种逆转录病毒和内源性逆转录元件的强大的天然免疫功能,近年来陆续有报道多个APOBEC3s蛋白具有抑制HBV复制的作用,并且其表达能被IFN、IL-2和TNF等细胞因子诱导,并且有报道APOBEC3s对HBV的抑制作用并不完全依赖于脱氨酶活性。本课题组早期研究发现A3B能抑制HBV s基因启动子的活性并能通过与hnRNPK的结合抑制HBV的复制。综合先前的研究,我们用多种分子生物学技术探究A3DE对HBV是否具有抑制作用；该抑制作用是否依赖于脱氨酶活性；其表达能否被细胞因子诱导上调;并对A3B对HBV的抑制机制作补充。本研究分为以下三个部分：第一部分体外细胞系中APOBEC3DE对HBV的抑制作用及其机制研究本部分旨在了解APOBEC3s家族中哪些成员对HBV HBsAg和HBeAg水平具有抑制作用,同时对被选出的A3DE进一步探索其抑制HBV的作用机制。我们做了APOBEC3s蛋白对HBV HBsAg和HBeAg表达水平的影响的一系列研究。通过体外瞬时共转染实验,分别将HBV表达质粒与A3s真核表达质粒或对照空载体pcDNA3.1共转染人肝癌细胞系HepG2中,应用电化学发光法（ECLIA）测定转染48h后细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果显示,A3B和A3DE对HBsAg和HBeAg的抑制作用最为显著,HBsAg和HBeAg的表达分别为对照组的18.48%±1.88%和28.37%±1.18%以及11.06%±0.44%和22.87%±0.9%；与A3B和A3DE相比,A3F.A3G和A3H对转染后HepG2细胞培养上清中HBsAg和HBeAg水平的抑制作用要弱得多,分别为对照组的39.53±5.97%和40.44%±1.05%,44.34±3.23%和52.74%±0.81%以及65.52±11.96%和57.1%±5.72%；A3A对HBsAg和HBeAg抑制作用很弱,为86.38±7.38%和91.82%±4.94%；而A3C对其无抑制作用,两蛋白表达水平分别为110.4±5.3%和91.82±4.94%。我们用PCR突变技术构建了A3DE酶活性中心的点突变体,以观察A3DE对HBV HBsAg和HBeAg表达抑制是否依赖于脱氨酶活性,结果显示A3DE对其的抑制并未受到酶活性中心突变的影响。进一步分析A3DE及其三个突变体对HIV-1病毒感染力的影响,与HBV不同的是,A3DE对Vif缺陷的HIV-1病毒感染力为对照组的2.94%±0.12%,而E80K、E80/264K和E264K分别为42.84%±6.78%,38.76%±8.92%和13.59%±3.12%,即对HIV-1感染率的抑制分别下降了大约39%,35%和10%,并且只有野生型A3DE包被在人HIV-1病毒中。为揭示A3DE能否抑制HBV基因表达,我们分析了上述转染细胞中HBV s基因的mRNA表达。提取上述共转染48h后HepG2细胞总RNA,通过半定量RT-PCR方法检测HBV s基因的mRNA水平,结果显示,共转染A3DE和HBV表达质粒的HepG2细胞中s基因mRNA水平与对照相比明显降低,提示A3DE能抑制s基因mRNA的表达。并且其突变体也能抑制其表达，上述两个结果表明A3DE既能抑制HBsAg蛋白的表达,又能抑制s基因mRNA表达。接着观察A3DE蛋白对HBV core DNA合成的影响。将HBV质粒与A3DE表达载体或对照空载体VR1012共转染HepG2细胞,提取和纯化转染48h后细胞内的HBV core相关DNA,并应用定量PCR方法对其定量,用3D-PCR技术检测A3DE能否突变HBV基因组。结果显示A3DE不能抑制HBV core相关DNA的合成,但是能突变HBV X基因DNA。第二部分A3DE在细胞内的表达及其调控研究这部分研究检测了A3DE在外周血单个核细胞、多株人肝细胞系和白血病细胞系、及肝组织中的表达情况,观察IFN和TNF刺激对A3DE表达的影响,旨在揭示ADE在体内表达的调控和作用。应用半定量RT-PCR方法检测了原代标本和细胞系A3DE的表达情况。7例健康成人外周血单个核白细胞中均有A3DE表达。表达存在着个体差异,其中有一例标本A3DE的表达呈较低水平,其余6例表达较强。HepG2.2.15由HepG2细胞稳定转染HBV表达质粒构建而成,前者的A3DE表达高于后者约1.5倍,这表明HBV的感染激发了细胞内A3DE的增高。在5株肝细胞肝癌细胞系和2株人正常肝细胞系中,A3DE有一定的表达,其中Huh-7细胞中的A3DE表达相对最高,但是这些细胞系细胞中的本底表达并不高,远远不及外周血单个核细胞。但人白血病细胞系中A3DE的表达水平不低于外周血单个核细胞。为探讨A3DE在肝组织中的表达我们分析了16对配对人肝癌和癌旁肝组织中A3DE基因的表达情况。结果显示在16对肝癌或癌旁组织中均有A3DE的表达,表达水平各有高低,对A3DE与GAPDH电泳条带的灰度比值进行统计分析发现肝癌和癌旁A3DE的表达并无统计学差异（P=0.1219）。接着检测了IFN和TNF刺激肝细胞系对A3DE表达的效应。结果显示4株人肝细胞肝癌细胞系和1株人正常肝细胞系细胞中的A3DE表达均能被IFN和TNF上调,以QGY-7703的上调最为显著,不同细胞株上调的程度和时间点的持续各有不同。综合第一二部分结果我们认为A3DE具有抗HBV复制能力,其表达和调控对HBV感染的预后和治疗有积极的提示意义。第三部分A3B对HBV复制的抑制不依赖于N端和C端的胞嘧啶脱氨酶本部分的实验方法与第一部分类似。我们先前研究发现A3B能抑制HBV s基因的启动子活性并能通过与hnRNPK的结合来抑制HBV Enh II的作用,为进一步补充其抑制机制,构建了A3B两端的酶活性中心点突变体,用共转染和免疫沉淀技术验证A3B酶活性失活后仍能抑制HBV复制并与hnRNP K的结合不受影响。实验结果显示,以对照组中HBsAg和HBeAg的表达为100%, A3B、C100S、C289S和C100/289S中HBsAg的表达分别为对照组的18.98%±1.81%、17%±0.84%、20.89%±0.65%和19.39%±1.22%；HBeAg的表达为对照组的30%±2.8%27.45%±0.58%、33.05%±±2.54%和32.39%±±4.24%,突变体对HBV的抑制并不低于野生型A3B。通过RT-PCR方法检测HBVs基因mRNA水平,与对照相比,A3B和其突变体的HepG2细胞中的s基因mRNA水平明显降低。最后免疫共沉淀（IP）方法证实A3B三个突变体蛋白与野生型A3B相比,与hnRNP K的结合能力未受影响。这部分实验进一步证实了脱氨基作用并非A3B抑制HBV复制的主要手段,为APOBEC3s抑制HBV研究提供了新的方向。综合前两部分研究得出结论：A3DE具有不依赖于胞嘧啶脱氨酶活性的强大的抗HBV复制的能力；与A3B不同,A3DE的表达与人肝细胞肝癌发生无关,其表达能被IFN和TNF等细胞因子诱导上调；A3B和A3DE对HBV复制的抑制都不依赖于两端的脱氨酶活性,说明脱氨基作用并非A3B和A3DE抑制HBV的主要手段;这些结果为APOBEC3s蛋白抗HBV病毒机制研究提供了新的思路并为人类乙型肝炎病毒的治疗提供了新的方向。
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