‘卡特’夏橙薄层细胞培养高频再生体系建立及转基因应用初探

论文摘要

柑橘是最重要的热带和亚热果树,产量位居世界水果之首。柑橘易遭受冻害和病虫害等自然与非自然因素影响,随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变,柑橘的育种目标也在不断发生变化。由于柑橘的多胚性、杂交不亲合性、雄性或雌性不育性等障碍,常规育种途径很难满足定向培育新品种的要求。基因工程的应用为柑橘品种的改良开辟了一条新途径,而建立一个高效的、适宜于遗传转化的柑橘离体再生系统则是开展转基因工作的基础。本研究以‘卡特’夏橙为试材,无菌条件下播种的实生苗为外植体,对播种预处理培养基,薄层细胞切割部位、放置方式及不定芽诱导培养基和光照条件进行了研究,对薄层细胞培养再生过程进行了细胞学观察,并以此为基础进行了农杆菌介导的转基因的初步研究。主要研究结果如下:1.传统的柑橘转基因再生体系都以黄化处理的实生苗上胚轴为材料,本试验对经过6种预培养培养基播种的实生苗进行黄化处理后,取上胚轴为外植体切割成1mm左右的薄切片,接种于12种不定芽诱导培养基中,比较黄化苗在根和上胚轴长度、粗度上的差异,结合薄层细胞切片制备的难易和薄层细胞切片生成愈伤的效率,得出黄化苗上胚轴薄层切片不定芽诱导培养基为MT+0.5mg/L BA+0.5mg/L KT+0.1mg/L NAA+30g/L Suc,其预处理播种培养基为1/2 MT。2.试验中发现,不经黄化处理的光照实生苗,其上胚轴用薄层细胞培养也能再生。上述黄化苗上胚轴薄层细胞不定芽诱导培养基也适用于光照苗薄层细胞不定芽的诱导,而其预培养最适培养基为MT+0.5mg/L BA+0.05mg/L IBA+0.2mg/L GA3+30g/L Suc。3.薄细胞层细胞不定芽诱导过程中受光照的影响较大,在培养的初期如果进行光照,切片很容易由于木质部与韧皮部的脱落而死亡,因此在诱导初期需给予一段时间的暗培养。然而,暗培养时间也不是无限制的,大于28d时,不定芽的再生效率和平均生芽个数显著减少。暗培养的间大于7d小于24d,不定芽的形成能力均较强,尤其以21d暗培养时产生的不定芽数量最多,平均每个外植体产生21.7个芽。4.采用薄层细胞培养方法,实生苗不同部位再生能力有差别。光照苗下胚轴再生频率最高,为67.2%;其次是上胚轴,为59.3%;最低为根,仅为27.5%。平均再生芽数以上胚轴最高,每个外植体可再生20.7个芽;其次为下胚轴,为16.3个芽;根的薄层细胞平均再生芽数仅5.3个。5.在同一段上胚轴薄层细胞切片,形态学上端比基部再生能力强,不定芽形成时间短,且生长势强。薄层细胞切片的放置方式也影响不定芽的再生效率,根据植物生长极性（正向）放置的薄层切片平均生芽个数高,为18.2。其不定芽的生长状况也优于反向放置的薄层切片,且在后期生长中不易出现玻璃化。6.通过对薄层细胞切片的细胞组织学研究,初步判定柑橘薄层细胞不定芽的来源极其广泛,有经过皮层薄壁细胞分化而来的,有经过维管束薄壁细胞分化而来的,并且木质部细胞也有脱分化形成不定芽的潜能。7.薄层细胞对Km极其敏感,筛选浓度在0mg/L时有不定芽产生,在10mg/L时即没有不定芽的产生,所以Km的选择压定为10mg/L。农杆菌的侵染浓度OD600为0.5时,侵染10min,经48～72h共培养,可瞬时检测到荧光。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 前人研究进展
• 1.2.1 柑橘离体器官培养和根癌农杆菌介导的遗传转化研究进展
• 1.2.2 薄层培养研究进展
• 1.3 本课题研究的内容及意义
• 1.4 本试验的研究路线
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试外植体材料的准备
• 2.1.2 根癌农杆菌菌株及质粒
• 2.1.3 主要培养基配方
• 2.1.4 主要仪器和试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 实生苗薄层细胞培养再生试验
• 2.2.2 不定芽的细胞学观察和倍性检测
• 2.2.3 转基因应用初探
• 3 结果与分析
• 3.1 薄层细胞培养再生体系的优化
• 3.1.1 黄化苗在不同播种预培养培养基中的生长状况
• 3.1.2 预培养及不定芽诱导培养基的筛选
• 3.1.3 预培养中激素与光照对实生苗生长状况的影响
• 3.1.4 不同预培养播种实生苗再生能力差异
• 3.1.5 实生苗上胚轴不同部位再生能力差异
• 3.1.6 暗培养和放置方式对不定芽发生的影响
• 3.1.7 不定芽的继代与生根
• 3.2 薄层培养不定芽发生的组织切片观察
• 3.3 薄层细胞培养再生不定芽的倍性检测
• 3.4 转基因应用初探
• 3.4.1 Km筛选的结果
• 3.4.2 GFP瞬间表达的结果
• 4 讨论与展望
• 4.1 关于柑橘以薄细胞层培养的再生方式
• 4.2 关于柑橘薄细胞层为外植体的遗传转化
• 参考文献
• 致谢