鹅细小病毒VP3-ELISA和NS2-ELISA检测方法的建立及抗体消长规律的测定

论文摘要

鹅细小病毒病（Goose parvovirus infection）又称小鹅瘟（Gosling plague,GP）或Derzsy’s病,主要侵害4日龄至20日龄雏鹅和雏番鸭,可以引起急性肠炎及肝、肾、心等实质脏器败血性病变,尤其以小肠部位的纤维性、栓塞性病变为主要特征。由于该病病程短、传播快、死亡率高,造成了严重的经济损失,是目前危害养鹅业健康发展的重要传染病之一。由于该病每年均有不同程度的流行,长期困扰着养鹅业的健康发展,所以需要一种准确、简便的诊断方法来对该病作出准确诊断。鹅细小病毒基因组含有两个主要开放性阅读框（ORF）,分别编码非结构蛋白和结构蛋白。VP3蛋白是鹅细小病毒的主要结构蛋白,暴露于病毒粒子表面,是病毒核衣壳的主要成分,约占总蛋白的80%,具有高度保守性。因其能刺激机体产生具有中和作用的抗体,是研制基因工程重组疫苗的首选目的基因。NS2蛋白作为非结构蛋白,主要参与病毒DNA的复制及调节基因的表达。目前对GPV非结构蛋白的研究较少,我们在实验中发现NS2蛋白具有抗原性,可以诱导机体产生抗体。所以选用结构蛋白VP3和非结构蛋白NS2作为检测抗原。本试验通过原核表达载体pET-30a,成功构建了pET-30a-NS2重组质粒,通过大肠杆菌表达系统表达GPV-NS2蛋白;对表达GPV-VP3蛋白的阳性菌鉴定正确,通过Ni-NTA系统对两种蛋白分别进行纯化,以纯化的NS2蛋白和VP3蛋白为检测抗原建立两种间接ELISA检测方法,并对其进行优化,确定最佳反应条件。我们应用建立的VP3-ELISA和NS2-ELISA两种检测方法分别对实验免疫的鹅血清抗体进行检测。结果表明VP3蛋白的抗体在免疫后第五周达到最高峰,之后略有下降,可持续到第十四周。NS2蛋白的抗体在免疫后第四周达到最高峰,可持续到第十四周。比较这两种蛋白的抗体消长规律可见,非结构蛋白NS2的抗体最高峰较结构蛋白VP3的早出现一周。通过与中和试验比较,建立的VP3-ELISA检测结果可以反映中和效价变化规律,有望代替中和试验。本研究建立了VP3-ELISA和NS2-ELISA检测方法,并对鹅细小病毒免疫后的抗体尤其是非结构蛋白进行监测,为鹅细小病毒病的快速诊断、疫情监测、流行病学调查和免疫抗体效价测定提供技术支持。本实验特别选择了GPV非结构蛋白NS2作为检测抗原,为将来使用重组结构蛋白亚单位疫苗免疫动物时鉴别自然感染与疫苗免疫奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 鹅细小病毒概述
• 1.1.1 GPV 的分类地位
• 1.1.2 GPV 的形态结构和理化特性
• 1.1.3 GPV 的宿主范围和培养特性
• 1.1.4 GPV 与MDPV 的关系
• 1.2 GPV 分子生物学研究进展
• 1.2.1 GPV 基因组的结构特点
• 1.2.2 GPV 基因组的转录和复制
• 1.3 GPV 病毒基因编码蛋白
• 1.3.1 GPV 的结构蛋白
• 1.3.2 GPV 的非结构蛋白
• 1.4 鹅细小病毒病
• 1.4.1 鹅细小病毒病的流行病学
• 1.4.2 鹅细小病毒的临床症状
• 1.4.3 鹅细小病毒病的病理学特征
• 1.4.4 鹅细小病毒病的诊断方法
• 1.4.5 鹅细小病毒病的特异性治疗
• 1.4.6 鹅细小病毒病的疫苗免疫预防
• 1.5 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 验材料
• 2.1.1 质粒与菌株
• 2.1.2 病毒
• 2.1.3 实验动物及标准血清
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 以NS2 蛋白为检测抗原的间接ELISA 检测方法的建立
• 2.2.1 原核表达载体pET-30a-NS2 的构建
• 2.2.2 NS2 蛋白的原核表达及纯化
• 2.2.3 重组NS2 蛋白间接ELISA 检测方法的建立
• 2.3 以VP3 蛋白为检测抗原的间接ELISA 检测方法的建立
• 2.3.1 VP3 蛋白的原核表达及纯化
• 2.3.2 重组VP3 蛋白间接ELISA 检测方法的建立
• 2.4 NS2-ELISA 和VP3-ELISA 的应用
• 2.4.1 GPV 免疫血清的制备
• 2.4.2 GPV 免疫后抗体消长规律的测定
• 2.5 中和试验
• 3 结果与分析
• 3.1 以NS2 蛋白为检测抗原的间接ELISA 检测方法的建立
• 3.1.1 pET-30a-NS2 重组表达载体的鉴定
• 3.1.2 NS2 基因的原核表达
• 3.1.3 NS2-ELISA 检测方法的建立
• 3.2 以VP3 蛋白为检测抗原的间接ELISA 检测方法的建立
• 3.2.1 VP3 基因的原核表达产物的SDS-PAGE 分析和Western blot 鉴定
• 3.2.2 VP3-ELISA 检测方法的建立
• 3.3 抗体消长规律测定
• 3.3.1 NS2 蛋白抗体消长规律
• 3.3.2 VP3 蛋白抗体消长规律
• 3.4 中和试验
• 4 讨论
• 4.1 ELISA 检测方法的建立
• 4.1.1 ELISA 检测抗原的选择
• 4.1.2 包被液的选择
• 4.1.3 血清稀释液的优化
• 4.1.4 显色液配方的调整
• 4.2 中和试验
• 4.3 抗体消长规律的测定
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文