肿瘤细胞株Hela膜表面糖链对GJIC的影响及机制的初步探讨

论文摘要

细胞间隙连接通讯（gap junction intercellular communication,GJIC）是以细胞间的间隙连接（gap junction,GJ）为途径进行的细胞间直接的信息交流的一种方式,可允许小于1-2kDa的小分子物质如金属离子、第二信使及其它小分子代谢产物通过,使细胞间可以不通过细胞外空间而达到直接通讯的目的。研究表明GJIC与肿瘤密切相关,多数肿瘤细胞表现为GJIC能力降低或丧失,因此有人推测恢复肿瘤细胞间或肿瘤细胞和对应正常细胞间的间隙连接,通讯功能可能会使其表型正常化,而恢复GJIC则可能抑制肿瘤发生发展,目前GJIC已成为肿瘤预防与治疗研究的潜在靶点之一。研究发现肿瘤细胞表面往往表现糖链异常增多且糖基异常化,糖基转移酶水平的改变经常引起的糖链结构变化,例如连接在天冬酰胺上的N-糖链,连接在丝氨酸和苏氨酸上的O-糖链,连接在丝氨酸上的糖胺聚糖（GAGs）,连在脂类物质上的糖脂等。唾液酸是细胞膜上糖蛋白和糖脂的重要成分,其代谢与肿瘤增殖、侵袭、转移有关。肿瘤细胞表面唾液酸含量明显升高,如在正常宫颈细胞中不表达或表达量很低,在宫颈癌组织中有表达;在细胞分化程度低、临床分期晚、发生转移、复发及预后差的患者中高表达。大量文献报道肿瘤细胞间的细胞通讯降低,一方面与连接蛋白43（connexin43,Cx43）的合成减少有关,另一方面也与Cx43不能形成正确完整的通道有关,推测可能是由于肿瘤细胞表面大量的异常糖链阻碍了GJIC孔道的形成。目前有研究证实使用衣霉素抑制细胞糖基化过程有助于通道的开放。我们推测肿瘤细胞表面表达异常增多的唾液酸也能阻碍GJs形成,进而抑制GJIC。在N-糖链的研究中,与GnT-V相关的β-1,6分支在肿瘤细胞表面往往也表现高表达,但在GJIC方面的作用也还未见报道,所以本文我们把GnT-V也作为一个研究对象。Cx43是一个不含糖基化位点的蛋白,因此唾液酸和β-1,6分支的减少不会对其起到直接的作用。推测其它蛋白上唾液酸和β-1,6分支的减少（如细胞间粘附分子）通过影响自身的功能,进而引起一系列的变化,从而影响了Cx43及其相关蛋白表达及分布,并进一步影响了通道的形成、开放。目前研究糖链主要通过化学工具药及分子生物学等手段,在本文中采用了化学工具药（衣霉素、唾液酸苷酶）以及RNA干扰的技术抑制糖基化,并利用了现代分子生物学技术,细胞生物学技术、多种激光生物学（LSM、FCM）技术,研究了肿瘤细胞株Hela膜表面大量异常糖链的表达对GJIC的影响,并对肿瘤细胞膜表面大量异常唾液酸表达抑制GJIC的机制进行了初步的探讨。本文利用衣霉素、唾液酸苷酶等化学工具药去除膜表面相应糖链以及RNA干扰技术瞬时沉默Hela细胞中GnT-V活性,经划痕染料示踪（SLDT）及荧光淬灭恢复（FRAP）实验检测,结果均都检测到HeLa细胞GJIC增强;唾液酸苷酶去除HeLa细胞表面α2-3及α2-6唾液酸后,通过对机制的初步探讨研究发现,Cx43表达水平及磷酸化变化不明显,但Cx43分布发生变化,使位于间隙连接斑处的Cx43增多;且另外两个Cx43相关蛋白ZO-1/N-Cadherin总体的表达量不变,但能降低N-Cadherin分子的唾液酸含量,导致N-Cadherin与Cx43共定位增多,同时使与Cx43结合的ZO-1增多,而使位于间隙连接斑处的Cx43增多,从而促进了GJIC功能。本文的研究有助于肿瘤细胞膜糖链的生物学功能的阐明,并为今后针对肿瘤通讯方面的药物开发提供了理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 HELA 细胞膜表面糖链对 GJIC 的影响
• 1.1 摘要
• 1.2 前言
• 1.3 实验材料及方法
• 1.3.1 试剂
• 1.3.2 仪器
• 1.3.3 常用缓冲液及其他溶液
• 1.3.4 实验方法
• 1.4 实验结果
• 1.4.1 N-糖链对Hela 细胞GJIC 的影响
• 1.4.2 唾液酸对Hela 细胞GJIC 的影响
• 1.4.3 β-1，6 分支对Hela 细胞GJIC 的影响
• 1.5 讨论
• 1.6 小结
• 第二章 HELA 细胞膜表面唾液酸表达对 GJIC 影响机制的初步探讨
• 2.1 摘要
• 2.2 前言
• 2.3 实验材料和方法
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验方法
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 WB 检测Hela 细胞内Cx43 表达水平及磷酸化
• 2.4.2 WB 检测Hela 细胞内ZO-1 表达
• 2.4.3 WB 检测HeLa 细胞内N-Cadherin 表达
• 2.4.4 细胞免疫荧光共定位检测Cx43 与ZO-1 的定位
• 2.4.5 细胞免疫荧光共定位检测Cx43 与N-Cadherin 的定位
• 2.4.6 IP 检测Cx43 与ZO-1 的相互作用
• 2.4.7 IP 检测Cx43 与N-Cadherin 的相互作用
• 2.4.8 IP 检测N-Cadherin 上唾液酸表达情况
• 2.5 讨论
• 2.6 小结
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 1. CX43 与ZO-1、C-SRC
• 2. CX43 与MAPK、MKP-1
• 3. CX43 和N-CADHERIN、连环蛋白P120
• 4. CX43 与骨架蛋白
• 4.1 Cx43 与微管蛋白
• 4.2 Cx43 与Actin
• 5. CX43 与DREBRIN
• 6. CX43 与CCN3
• 7. CX43 与CIP85
• 8. CX43 与CAVEOLIN
• 9. CX43 与CALMODULIN
• 10. 展望
• 致谢
• 个人简历
• 发表的学术论文