论文摘要
氢氰酸是极为重要的工业毒物,也是外军装备的速杀性化学战剂,《禁止化学武器公约》将其列为“双用途毒剂”。分子结构中含有氰根（CN-）的化合物多具有强烈毒性,人们称它们为氰类毒剂或氰化物。氰化物进入机体后迅速释放出氰离子（CN-）,CN-对细胞呼吸链有很强的亲和力,可与细胞色素氧化酶的三价铁（Fe3+）结合,抑制该酶的活性[1],阻断呼吸链电子传递,造成“内呼吸”障碍。呼吸衰竭和心血管功能衰竭是氰化物中毒死亡的主要原因[2,20]。高原地区空气稀薄,大气压和氧分压降低,是高原环境对机体影响的主要因素。缺氧既可以造成机体功能的异常反应[3],也可以加重化学毒物对脑、心、肺功能的损伤作用[4]。初入高原人员若发生氰化物中毒,机体将同时遭受呼吸性缺氧和细胞性缺氧双重打击,目前对缺氧条件下氰化物中毒的伤情特点了解甚少。肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar epithelial cell TypeⅡ,AECⅡ）是一种多功能细胞,对维持肺泡的结构和功能具有重要意义。既往研究发现,肺组织对缺血、缺氧损伤敏感。其中肺泡Ⅱ型上皮细胞的位置比较特殊,容易受到来自空气和血液两方面的损害。因此,AECⅡ在急性肺损伤后的变化非常复杂。急性肺损伤（ALI）肺组织的病理变化为肺泡上皮细胞的严重损伤。肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡,形态和结构发生改变,呼吸膜的完整性遭到破坏,导致其功能异常,主要表现为肺表面活性物质（pulmonary surfactant,PS）系统的异常,表面活性物质是呼吸不可缺少的物质,这种基本物质的缺乏、不足和失活是引起严重呼吸功能失调的原因。近年来,随着对急性肺损伤发病机制及防治措施研究的深入,发现急性肺损伤时常伴有表面活性蛋白含量的降低[43]。AECⅡ的增殖和分化不仅可以修复肺泡的正常结构,更可以有效地进行功能上的恢复,从而阻止肺损伤向ARDS发展。AECⅡ是肺泡上皮细胞的干细胞,AECⅡ细胞的凋亡在ALI的病理过程中至关重要。研究表明,细胞凋亡可发生于ALI的不同阶段和时期。AECⅡ是肺部特异性细胞,有着极其重要的生理病理功能,是急性肺损伤发病过程中的重要效应细胞,在发病早期即可出现异常改变,其受损的确切机制尚未完全阐明,目前研究认为,肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡及相关基因表达异常可能参与ALI的发病机制[42]。为了阐明缺氧复合氰化物中毒对肺损伤的特点及其机制,本课题以肺泡II型上皮细胞为研究目标,从缺氧与NaCN中毒对整体动物呼吸系统结构和功能指标的影响及对离体AEC II毒性作用研究,从肺组织及AEC II结构变化、肺血管通透性、BALF和肺组织均浆主要成分改、氧化应激状态变化以及AEC II合成SP-A的能力、相关凋亡基因HIF-1α和P53蛋白表达情况等方面,研究复合缺氧损伤引起AEC II功能状态改变与急性肺损伤的关系,以进一步明确复合缺氧损伤AEC II发生凋亡的可能机制,为缺氧和NaCN中毒后导致的急性肺损伤的诊断和防治提供理论依据。方法:1:大鼠缺氧与NaCN中毒损伤模型:高原实验组预缺氧72h后皮下注射NaCN 3.60mg/K。利用光镜和免疫组织化学方法观察大鼠肺组织病理损伤、SP-A活性改变以及AEC II凋亡相关基因HIF-1α和P53的表达情况;多道生理信号记录系统观察缺氧和NaCN中毒对大鼠呼吸功能的影响;生化分析测定肺血管通透性变化、BALF成分变化趋势和肺组织。2:离体AEC II缺氧与NaCN中毒模型:观察NaCN对AEC II的毒性作用;Western Blot测定SP-A,HIF-1α和P53蛋白表达情况;PI-3K/AKT通路特异性抑制剂LY294002,P53抑制剂PFT-α对缺氧与NaCN中毒AEC II生成SP-A的干预作用。结果:一、缺氧与NaCN中毒动物模型1、缺氧和氰化钠中毒大鼠肺组织结构出现病理损伤,肺泡间质形态学结构改变,并出现变性损伤。缺氧和氰化钠中毒大鼠AEC II变性损伤显著,板层体排空,细胞呈空泡状。2、缺氧和（或）氰化钠中毒可诱导大鼠肺组织HIF-1α、P53表达增强,SP-A表达减弱。3、常氧大鼠NaCN中毒后肺干湿质量比、肺体比值增加,缺氧大鼠NaCN中毒肺干湿质量比、肺体比值在各时相点均明显高于常氧对照组、缺氧对照组（P<0.05）。4、常氧NaCN中毒增加大鼠支气管肺泡灌洗液中细胞数,缺氧中毒组支气管肺泡灌洗液中细胞计数各时相点均明显高于常氧中毒组、缺氧对照组（P<0.01）。5、常氧NaCN中毒增加大鼠支气管肺泡灌洗液中蛋白含量,缺氧中毒组支气管肺泡灌洗液中蛋白含量各时相点均明显高于常氧中毒组,缺氧对照组（P<0.01）。6、常氧NaCN中毒升高大鼠BALF的TPL含量,缺氧对照组TPL含量明显高于常氧对照组,皮下注射NaCN后,TPL显著高于缺氧对照组（P<0.05）。常氧NaCN中毒后肺组织TPL含量显著下降,缺氧对照组肺组织中TPL含量低于常氧对照组NaCN染毒后进一步下降（P<0.05）。7、常氧大鼠NaCN中毒后肺组织伊文思蓝含量先增高后逐渐恢复,中毒1h左右为肺损伤高峰期。缺氧大鼠NaCN中毒后肺组织伊文思蓝含量随时间延长而递增,各时相点均明显高于常氧中毒组和缺氧对照组（P<0.01）。NaCN中毒动物后BALF中LDH、ACP及AKP活性明显增高,0.5h最高,在缺氧与NaCN中毒后BALF中LDH、ACP及AKP活性明在同一时相点明显高于单纯NaCN中毒（P<0.01）。8、NaCN中毒后肺组织和支气管肺泡灌洗液中的GSH含量、SOD活力、GSH-PX活力的下降、MDA的含量增加。各指标的变化幅度远大于单纯NaCN中毒的效应（P<0.01）。二、缺氧与NaCN中毒AEC II模型1、氰化钠对肺泡II型上皮细胞具有毒性作用。氰化钠染毒后肺泡II型上皮细胞形态变化明显,胞体变圆,细胞突起变短或消失,胞核形态不规则;随着染毒剂量的增大,损伤程度明显加重,胞浆内出现中毒颗粒,细胞数量明显减少。2、氰化钠可显著降低肺泡II型上皮细胞活力。染毒浓度越高,肺泡II型上皮细胞活力越低,并存在明显的剂量依赖关系（P<0.01）。3、缺氧或（和）NaCN中毒导致体外培养肺泡II型上皮细胞SP-A表达明显降低,在缺氧与NaCN中毒时降至最低,与单一缺氧因素作用有显著的统计学意义（P <0.01）。在NaCN中毒或缺氧情况下,均可引起AEC II内P53蛋白的表达增强,缺氧组与NaCN中毒组有明显差异（P <0.01）。在NaCN中毒或缺氧情况下,均可引起AEC II内HIF-1α蛋白的表达增强。缺氧与NaCN中毒时,AEC II的HIF-1α蛋白表达为正常对照组的8.5倍（P <0.01）。4、使用LY294002或PFT-α预处理AEC II,可以显著的提高复合缺氧损伤SP-A含量的减少（P<0.01）。两种抑制剂同时作用胞内SP-A含量是复合缺氧损伤组的428% （P<0.01）。与缺氧复合损伤组相比,加入药物LY294002干预的AEC II内HIF-1α蛋白表达降低了55%（P<0.01）。加入PFT-α预处理的AEC II内HIF-1α蛋白表达与LY294002干预组有明显差异（P<0.01）。LY294002和PFT-α均可降低缺氧与NaCN中毒AEC II的P53蛋白的表达。与缺氧复合损伤组比较,PFT-α预处理组AEC II的P53蛋白表达降低最显著,降低了76.7%（P<0.01）。LY294002干预组降低P53蛋白的表达量22.4%（ P<0.01）,联合用药组降低P53蛋白的表达量38%（ P<0.01）。结论:1、成功建立了大鼠缺氧与NaCN中毒动物模型。研究发现,缺氧与NaCN中毒对大鼠呼吸频率的改变表现为出现时间早,持续时间长,变化大。缺氧环境下氰化钠中毒所造成的呼吸频率变化比平原组严重而持久。提示缺氧和氰化钠中毒对呼吸功能可能有联合损伤效应。病理组织检查检查发现缺氧或（和）NaCN对大鼠肺组织具有损伤作用,可使肺组织结构出现明显病理改变,肺泡间质形态学结构改变,并出现变性损伤。超微结构检查发现AEC II变性损伤显著,板层体排空,细胞呈空泡状。AEC II发生形态学改变并发生变性损伤,可能是导致缺氧和NaCN中毒肺急性损伤的根本原因。2、肺体比值、肺干湿质量比、BALF中的细胞计数、总蛋白含量、总磷脂含量与肺血管通透性实验结果均提示,缺氧或NaCN中毒均可损伤肺泡的组织结构,导致通透性增加,液体自血管渗入肺泡和间质中,BALF中蛋白含量增高可能是BALF中TPL含量先增高然后随着PS的灭活而降低,肺组织TPL下降提示肺泡上皮细胞发生损伤。在缺氧与NaCN中毒后BALF中LDH、ACP及AKP活性明在同一时相点明显高于单纯NaCN中毒（P<0.01） ,提示缺氧和氰化钠中毒的毒性对大鼠肺损伤作用加强。3、NaCN中毒后肺组织和支气管肺泡灌洗液中的GSH含量、SOD活力、GSH-PX活力的下降、MDA的含量增加。各指标的变化幅度远大于单纯NaCN中毒的效应（P<0.01）。提示氧化应激机制在缺氧复合氰化物中毒中发挥一定作用。4、缺氧或（和）NaCN中毒导致体外培养肺泡II型上皮细胞SP-A表达明显降低,P53蛋白、HIF-1α蛋白的表达增强。SP-A的变化可能是BALF中总蛋白含量和总磷脂含量先升高后降低的主要原因之一。在缺氧与NaCN中毒时SP-A表达降至最低,提示两种缺氧因素可能加重AEC II的损伤,AEC II功能损伤可能与P53、HIF-1α表达增强有关,HIF-1α可能是AEC II凋亡途径的枢纽信号。5、使用LY294002或（和）PFT-α预处理AEC II,可以显著的提高复合缺氧损伤SP-A含量的减少,明显降低AEC II内HIF-1α蛋白、P53蛋白的表达。提示缺氧和NaCN中毒AEC II功能改变可能是HIF-1α、P53介导的AEC II凋亡所致。
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标签：缺氧论文; 氰化钠论文; 肺泡型上皮细胞论文; 急性肺损伤论文; 肺表面活性物质结合蛋白论文; 缺氧诱导因子论文;