紫茎泽兰高温耐受性分化的荧光检测及其分子机制的初步研究

论文摘要

紫茎泽兰（Ageratina adenophora）是一种繁殖力强、生长速度快、生态适应性广的外来入侵植物。它侵占农田、果园、荒地、山地、草场,危害农林牧业,破环生态系统,致使本地的生物多样性严重丧失,给当地的生产生活带来严重影响。紫茎泽兰遗传多样性十分丰富,对多变的气候和生境条件产生了明显的生态适应性分化,对高温的生态适应性分化是最主要的表现之一,这有助于紫茎泽兰入侵更广阔的区域。但是,其耐热性分化的机制并不清楚。本文通过与耐热性有关的基因克隆和对基因功能表达的分析以及比较不同种群的叶绿素荧光动力学参数,目的是为了揭示耐热性分化的分子机制以及光合机制。通过对一些细胞质classI小热激蛋白的同源性比较设计简并引物,利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰（Ageratina adenophora）叶片总RNA中扩增出了细胞质classI小分子量热激蛋白HSP17.7和HSP17.6,它们的基因登录号是EF105483和EF520125。通过半定量分析,HSP17.7基因在常温下也有表达,表明HSP17.7编码组成型热激蛋白,但在叶中的表达量高于茎和根中的。在热激（40℃）和冷处理（4℃）的情况下,在根、茎、叶中的表达量均有增加。热激8小时,HSP17.7的表达量达最高。HSP17.7基因重组子在大肠杆菌中过量表达,以研究其在热和冷胁迫下的功能。SDS-PAGE凝胶电泳,显示PET+HSP细胞中有过量表达的大小约为24 kD的特异蛋白质条带。高温处理后大肠杆菌的蛋白质降解,并且表达HSP17.7蛋白的PET+HSP细菌的蛋白降解程度小于转空载体PET28a的PET细菌。37℃野生菌、转空载体PET和转基因PET+HSP的菌的生长速度相似。在致死温度（50℃）下,生存率高于对照。4℃条件下,情况相同。这些结果表明小热激蛋白HSP17.7在紫茎泽兰耐热和耐冷胁迫中均发挥作用。为可以更好的理解紫茎泽兰的生理生态适应机制,本文研究了大理种群、黄果树种群和玉溪种群光合作用的热稳定性差异。测定了不同温度处理后三者的叶绿素荧光参数、电解质渗漏量的变化,评定了三者光合作用对温度响应的差异。大理种群Fo快速升高的温度拐点（38℃）比黄果树种群（40℃）低2℃比玉溪种群（45℃）低7℃,随着温度升高大理种群各荧光参数的下降速率均大于黄果树种群和玉溪种群,电解质渗漏量随温度变化的趋势与光合能力的变化趋势一致。结果表明PSⅡ热损伤的主要部位是位于PSⅡ供体侧的放氧复合体（OEC）,PSⅡ的结构与功能对热的稳定性不同,可能是种群耐热性不同的原因。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 外来入侵植物成功入侵的特点
• 1.1.1 繁殖特性
• 1.1.2 传播特性
• 1.1.3 对环境的忍耐性
• 1.1.4 表型可塑性
• 1.1.5 遗传结构
• 1.1.6 化感作用
• 1.2 紫茎泽兰侵入扩张的机理研究
• 1.2.1 紫茎泽兰侵入扩张的分子机理研究
• 1.2.2 紫茎泽兰有利于入侵的生物学特性
• 1.2.3 紫茎泽兰的生态适应性
• 1.2.4 紫茎泽兰的化感作用
• 1.3 植物小热激蛋白的研究进展
• 1.3.1 小分子热激蛋白的基本性质
• 1.3.2 sHSPs的功能
• 1.4 叶绿素荧光动力学在耐热生理研究中的应用
• 1.4.1 快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的意义
• 1.4.2 叶绿素荧光在植物热胁迫研究中的应用
• 第二章 高温下紫茎泽兰HSP17.7基因的克隆和序列分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 碱裂解法少量提取质粒溶液配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 利用TAINGEN公司的RNA提取试剂提取RNA
• 2.2.2 反转录cDNA第一条链的合成
• 2.2.3 设计简并引物得到HSP17.7基因的中间片段
• 2.2.4 用RACE法得到HSP17.7基因的cDNA 3′端片段
• 2.2.5 用RACE法得到HSP17.7基因的cDNA 5′端片段
• 2.2.6 HSP17.7基因全长cDNA的克隆
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 紫茎泽兰HSP17.7的克隆
• 2.3.2 内含子检测
• 2.3.3 HSP17.7基因分析
• 2.4 讨论
• 第三章 半定量RT-PCR检测高温条件下不同种群小热激蛋白HSP17.7基因表达差异
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 酶及生化试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 PCR引物设计
• 3.2.2 总RNA的提取与完整性检测
• 3.2.3 去除DNA
• 3.2.4 反转录反应
• 3.2.5 HSP17.7和actin基因的PCR扩增
• 3.2.6 引物对之间竞争的控制
• 3.2.7 PCR反应产物的检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 紫茎泽兰总RNA完整性及纯度检测
• 3.3.2 引物对之间竞争对PCR的影响
• 3.3.3 半定量RT—PCR循环次数的确定
• 3.3.4 半定量RT-PCR体系的重复性检测
• 3.3.5 半定量RT—PCR检测HSP17.7基因的表达
• 3.4 讨论
• 第四章 紫茎泽兰小热激蛋白HP17.7基因的原核表达
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 酶及生化试剂
• 4.1.2 菌株与质粒
• 4.1.3 主要试剂的配制
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 引物设计
• 4.2.2 重组质粒及表达载体质粒DNA的制备
• 4.2.3 酶切及酶切产物回收
• 4.2.4 目的片段与表达载体pET-28a vector的连接
• 4.2.5 转化及筛选
• 4.2.6 融合表达载体的转化
• 4.2.7 融合蛋白的诱导表达
• 4.2.8 SDS聚丙烯酰胺电泳检测
• 4.2.9 不同条件下大肠杆菌的生长曲线
• 4.2.10 大肠杆菌细胞活力实验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 大肠杆菌表达载体PET+HSP的构建和鉴定
• 4.3.2 不同条件下大肠杆菌的生长曲线
• 4.3.3 异源表达HSP17.7基因提高大肠杆菌在极端温度下的生存能力
• 4.4 讨论
• 第五章 紫茎泽兰高温耐受性分化的荧光检测
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.3 方法
• 5.2 结果
• o等参数的影响'>5.2.1 热胁迫对F_o等参数的影响
• 5.2.2 高温对紫茎泽兰电解质渗漏量的影响
• 5.3 讨论
• 全文讨论与总结
• 参考文献
• 致谢