论文摘要
背景肾脏纤维化是各种原因肾脏疾病进展到慢性肾衰竭的共同途径和主要病理基础,是各种肾小球病变发展至终末期的一种不可逆的病理改变,包括肾小球硬化、肾小管萎缩和毁损、细胞外基质（ECM）异常增多和过度沉积等病理过程,其发病机制尚未完全明晰,治疗难度大,预后较差,因此探讨肾小球硬化机制及防治措施在临床上有很重要的意义。肾小球硬化初期表现为局灶节段性,后期则表现为弥漫性球状分布,其病理演变过程分为肾小球肥大期、系膜硬化期、血管腔闭塞期,这一演变过程是许多肾脏疾病进展到肾衰竭的共同道路;JAKs/STATs信号转导途径是细胞因子实现生物学功能的主要途径之一,它已成为当前细胞因子研究领域的热点。信号转导与转录激活因子（STATs）作为JAKs的靶蛋白,是存在于胞质中的一个转录因子家族,STAT3是该家族的重要成员,是一类由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子。研究表明STAT3途径不仅是参与肾脏生理过程中是的一个很重要的信号转导途径,而且参与多种增生性肾小球疾病有关。苦参碱（matrine）是药用豆科槐属植物苦参（Sophora flavescens Ait）的干燥根分离提取的生物碱,有多方面的药理作用和功效,如抗菌、抗炎、抗风湿、抗肿瘤、抗过敏、抗心律失常、消肿利尿、免疫及生物反应调节作用等。研究发现苦参碱可降低肾病综合征大鼠的蛋白尿和管型尿,减轻肾脏病理改变、减少足细胞融合,对TGF-β1的产生及Smad信号通路有一定的影响。近年来研究发现苦参碱具有就抑制成纤维细胞及胶原合成,防治实验性大鼠肝纤维化的作用。但其对肾小球硬化作用及机制目前尚未完全明晰。阿霉素所致的肾小球硬化动物模型是一稳定的肾小球硬化模型,以大量蛋白尿为突出特点,具有慢性进展性肾损害的特点,与人类进行性肾脏疾病的表现非常类似。本课题拟观察肾小球硬化过程中大鼠肾脏STAT1、STAT3、转化生长因子β1（TGF-β1）、Ⅳ型胶原（COL-Ⅳ）的变化及JAK2、STAT1、STAT3mRNA的表达,考察JAKs/STATs信号转导通路在肾小球硬化进程中的变化;同时观察了该模型大鼠经苦参碱干预治疗后肾组织STAT3、TGF-β1蛋白表达及STAT3、PIAS3mRNA表达,探讨苦参碱在肾小球硬化治疗作用及其机制,为临床防治肾小球硬化寻找新的途径。第一部分JAK/STAT信号转导通路在阿霉素肾小球硬化大鼠模型中的研究目的:动态观察阿霉素肾小球硬化大鼠模型肾脏纤维化发生、发展过程中JAK/STAT信号转导通路各信号分子的表达,探讨JAK/STAT信号转导通路肾小球硬化发病机制中的作用。方法:30只健康雄性Wistar大鼠随机分为模型组和对照组各15只,模型组左侧肾切除及1周后尾静脉注射阿霉素5mg/kg制备肾小球硬化模型;对照组行假手术及1周后尾静脉注射同剂量蒸馏水,2、4、6周分批处死模型组及对照组各5只大鼠,检测血清肌酐、尿素氮和24小时蛋白尿变化,HE和Masson染色观察肾小球硬化指数变化,以免疫组化法观察肾脏纤维化过程中大鼠肾脏STAT1、STAT3、TGF-β1、COL-Ⅳ表达及采用荧光实时定量PCR的方法检测JAK2、STAT1、STAT3mRNA表达。结果:模型组血清肌酐（123.3±20.9μmol/L）、尿素氮（25.8±3.8μmol/L）和24小时蛋白尿（58.9±9.7mg/d）从2周起逐渐增高,至第6周明显高于正常对照组（68.3±8.3μmol/L）、（14.8±2.0μmol/L）和（9.6±1.1 mg/d）（p＜0.05）;模型组肾小球硬化指数（71.7±11.2%）明显高于正常对照组（17.6±2.5%）（p＜0.05）;TGF-β1、COL-Ⅳ在6周肾小球硬化大鼠模型肾皮质表达（TGF-β1:2.196±0.394%;COL-Ⅳ:5.26±1.66）明显多于对照组（TGF-β1:0.017±0.005%;STAT3:7.64±1.25%）（p＜0.05）,呈逐渐升高趋势,模型制备成功;STAT3（19.6±2.6%）蛋白从4周起表达较正常对照组（7.64±1.2%）明显增高（p＜0.05）,主要以胞浆表达阳性为主,部分呈胞核表达阳性;但STAT1蛋白表达模型组（6.76±1.1%）与对照组（5.73±1.0%）无明显差别;JAK2、STAT1、STAT3mRNA6周后模型组表达（7.28±1.53、4.13±0.34、5.06±0.26倍于对照组）明显多于对照组（p＜0.05）。小结:JAK/STAT信号转导通路参与了肾小球硬化形成的信号转导过程,伴随着JAK2、STAT1、STAT3信号分子表达的增多以及TGF-β1、COL-Ⅳ等蛋白表达增加,这条通路可能是介导肾脏细胞外基质大量沉积、肾脏纤维化发生及发展的细胞内信号转导途径之一。而STAT1 mRNA表达升高,STAT1蛋白表达却升高不明显,可能与体内代偿机制及蛋白质-mRNA表达不同步有关。第二部分苦参碱对阿霉素诱导的肾小球硬化大鼠STAT3信号分子的影响目的:动态观察苦参碱对阿霉素诱导的肾小球硬化大鼠STAT3分子及其抑制分子PIAS3变化的影响,探讨苦参碱在肾小球硬化发病进程中的作用及其机制。方法:45只健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组、模型组及试验组各15只,用单侧肾切除加1wk后尾静脉注射阿霉素（5mg/kg）的方法建立肾小球硬化大鼠模型,为模型组;只行手术不注射阿霉素为对照组;造模后即予苦参碱100 mg/kg·d灌胃干预治疗为试验组。于2、4、6 wk分批处死每组各5只大鼠,以免疫组化检测肾脏STAT3、TGF-β1表达,实时荧光定量PCR技术观察STAT3、PIAS3 mRNA表达。结果:第6wk时,模型组肾小球硬化指数（71.7±11.2%）高于对照组（17.6±2.5%）及试验组（44.9±8.9%）（p＜0.01）;模型组TGF-β1在肾皮质表达（2.196±0.394%）多于对照组（0.017±0.005%）及试验组（0.750±0.089%）（p＜0.01）,并呈逐渐升高趋势;模型组STAT3蛋白（19.58±2.66%）表达较对照组（7.64±1.25%）增高（p＜0.01）,试验组（14.90±1.66%）较模型组（19.58±2.66%）降低（p＜0.01）;模型组STAT3 mRNA表达为5.06±0.26倍于对照组,高于试验组的3.49±0.39倍（p＜0.01）,而PIAS3 mRNA呈相反趋势。小结:苦参碱有抑制肾小球硬化进展的作用,其作用机制可能为下调JAK/STAT通路信号分子STAT3及上调其抑制分子PIAS3的表达,降低TGF-β1的蛋白水平,从而延缓肾小球硬化进程。结论1.JAK/STAT信号转导通路参与了肾小球硬化形成的过程,其信号分子JAK2、STAT1、STAT3是其中重要的环节之一;2.TGF-β1、COL-Ⅳ等蛋白可能通过直接刺激JAK/STAT信号转导通路JAK2、STAT1、STAT3信号分子的活化,来介导肾小球硬化的进程;抑或JAK/STAT信号转导通路介导了TGF-β1、COL-Ⅳ等致纤维化因子的产生。3.苦参碱可下调STAT3及上调其抑制分子PIAS3的表达,并有抗纤维化的作用,其机制可能是通过JAK/STAT信号转导通路起作用。