新型人源性穿膜肽机理研究及性质比较

论文摘要

细胞穿膜肽（Cell-penetrating peptides,CPPs）,通常由多个碱性氨基酸构成的带正电荷的短肽,能够作为运输载体,携带物质进入到细胞,但其穿膜机制依然存在很大争议。利用荧光蛋白作为报告蛋白,经过构建、表达纯化而得到不同的穿膜肽融合蛋白,利用荧光显微镜、激光共聚焦和流式细胞术对其穿膜机制和穿膜效率进行检测。本实验通过分子生物学技术,构建得到EGFP-CS、EGFP-CS4、EGFP-TAT、 TAT-mCherry、Nus-S Tag-EGFP-CS、EGFP-CPPs等在内的多种重组蛋白,经表达优化,利用Ni-NTA层析柱纯化得到的目的蛋白,其纯度均可达到95%以上。研究融合蛋白EGFP-TAT、EGFP-CS和EGFP-CS4在不同浓度及不同时间下,对细胞的穿膜效率变化,三者的穿膜作用均具有浓度时间依赖性。通过研究各内吞途径抑制剂对上述三种融合蛋白对细胞穿膜活性的变化,初步鉴定穿膜肽CS和CS4主要依赖于和细胞膜上的硫酸蛋白聚糖的吸附,另外少量也可以通过其他途径进入细胞,即可能为混合途径。穿膜肽CS携带大分子量蛋白Nus-S Tag-EGFP,虽然在同浓度下,其荧光活性相对EGFP-CS较弱,但随浓度增加,可以在细胞内检测到其荧光活性逐渐增强,这表明大分子物质对穿膜肽的穿膜作用具有一定的影响,但依然可有效对其进行跨膜运输。将不同穿膜肽作用于多种细胞的研究发现,穿膜肽CS和CS4具有相对的广谱性,但对于所选用的MKN和A549两种细胞,其穿膜效率较差,因此穿膜作用可能具有组织特异性。比较多种人源性穿膜肽的穿膜效率,以筛选出高效、低毒的人源性穿膜肽作为药物蛋白的穿膜载体,实现其药理效果,研究表明,多种人源性的穿膜效肽具有较高的穿膜效率,可应用于临床医药。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 细胞穿膜肽的发展
• 1.2 细胞穿透肽：多功能的生物分子运输载体
• 1.3 细胞穿膜肽的分类
• 1.4 细胞穿膜肽的摄入方式及机制研究
• 1.5 影响细胞摄入机制的因素
• 1.6 细胞穿透肽运输寡核苷酸
• 1.7 细胞穿透肽的细胞内化机制
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 酶与生物试剂
• 2.1.2 培养基配方
• 2.1.3 大肠杆菌菌株及质粒
• 2.1.4 动物细胞
• 2.1.5 细胞培养基
• 2.1.6 仪器与设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 寡核苷酸链与表达载体的重组构建
• 2.2.2 融合蛋白的表达纯化
• 2.2.3 Ni-NTA Agarose柱层析纯化
• 2.2.4 爬片制备
• 2.2.5 流式细胞术
• 2.2.6 其他
• 第三章 穿膜肽CS和CS4的穿膜机理研究
• 3.1 穿膜肽CS、CS4和TAT相关融合蛋白的构建及表达纯化
• 3.1.1 融合蛋白EGFP-CS、EGFP-CS4和EGFP-TAT的纯化
• 3.1.2 融合蛋白TAT-mCherry的构建及表达纯化
• 3.2 穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用时间依赖性
• 3.3 穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用浓度依赖性
• 3.3.1 激光共聚焦观察穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用浓度依赖性
• 3.3.2 流式细胞术检测穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用的浓度依赖性
• 3.4 不同抑制剂对穿膜肽TAT、CS和CS4穿膜作用的影响
• 3.5 穿膜肽CS携带大分子量货物蛋白的穿膜作用
• 3.5.1 重组质粒pET43.1-egfp-cs的构建
• 3.5.2 融合蛋白Nus-S Tag-EGFP-CS的表达及纯化
• 3.5.3 融合蛋白Nus-S Tag-EGFP-CS对细胞穿膜作用实验
• 3.5.4 结论
• 3.6 穿膜肽CS内吞途径研究
• 3.7 穿膜肽CS、CS4和TAT穿膜作用的细胞特异性
• 3.7.1 穿膜肽CS、CS4和TAT对HeLa细胞穿膜活性比较
• 3.7.2 穿膜肽CS、CS4和TAT对Bcap细胞穿膜活性比较
• 3.7.3 穿膜肽CS、CS4和TAT对A549细胞穿膜活性比较
• 3.7.4 穿膜肽CS、CS4和TAT对MKN细胞穿膜活性比较
• 3.7.5 穿膜肽CS、CS4和TAT对OK细胞穿膜活性比较
• 3.7.6 穿膜肽CS、CS4和TAT对CHO细胞穿膜活性比较
• 3.7.7 结论
• 第四章 不同人源性穿膜肽穿膜作用比较
• 4.1 不同人源性穿膜肽重组质粒的构建
• 4.1.1 重组质粒pET28a-egfp-tctp的构建
• 4.1.2 重组质粒pET28a-egfp-arf的构建
• 4.1.3 重组质粒pET28a-egfp-bagp的构建
• 4.1.4 重组质粒pET28a-egfp-cyt c的构建
• 4.1.5 重组质粒pET28a-egfp-hclock的构建
• 4.1.6 重组质粒pET28a-egfp-hct的构建
• 4.1.7 重组质粒pET28a-egfp-hlf的构建
• 4.1.8 重组质粒pET28a-egfp-hph的构建
• 4.1.9 重组质粒pET28a-egfp-nrtn的构建
• 4.2 不同人源性穿膜肽融合EGFP蛋白的表达
• 4.2.1 融合蛋白EGFP-TCTP的表达
• 4.2.2 融合蛋白EGFP-ARF的表达
• 4.2.3 融合蛋白EGFP-BagP的表达
• 4.2.4 融合蛋白EGFP-Cyt c的表达
• 4.2.5 融合蛋白EGFP-hClock的表达
• 4.2.6 融合蛋白EGFP-hCT的表达
• 4.2.7 融合蛋白EGFP-hLF的表达
• 4.2.8 融合蛋白EGFP-Hph的表达
• 4.2.9 融合蛋白EGFP-NRTN的表达
• 4.3 各人源性穿膜肽融合蛋白EGFP的纯化
• 4.4 各人源性穿膜肽对cos-7细胞穿膜作用比较
• 4.5 结论
• 第五章 总结
• 5.1 穿膜肽CS和CS4的穿膜机制研究
• 5.2 穿膜肽CS和CS4对细胞特异性的研究
• 5.3 穿膜肽携带大分子量物质的穿膜效率研究
• 5.4 不同人源性穿膜肽的穿膜作用比较
• 参考文献
• 致谢