论文摘要
目的:通过建立肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的人晶体上皮细胞（HLE-в3）炎症损伤模型,观察炎症损伤后细胞性状的改变,研究核因子-kB（NF-кB）上游抑制因子IkB的激酶-α亚单位（IKK-α）在炎症损伤中的表达变化及作用。利用RNA干扰（RNAi）技术,探讨人晶状体上皮细胞中激酶IKKα亚单位小干扰RNA（siRNA）转染HLE-B3细胞后对炎症损伤诱导的IKK-α及下游因子表达的抑制作用。方法:1.将人重组TNF-α加入HLE-B3细胞的培养液中,使终浓度为20ng/ml,分别孵育6h、12h、24h及48h以制备HLE-B3细胞的炎症损伤模型。倒置显微镜下观察细胞性状的变化,采用免疫组织化学和实时荧光定量PCR的方法,分别检测IKK-α蛋白及其mRNA的表达变化。2.采用荧光标记siRNA与转染试剂HiperFect2000的不同浓度组合,分别转染HLE-B3细胞,12h后在荧光倒置显微镜下观察转染效率,MTT法检测转染复合物的毒性,对转染条件进行优化。3.设计并体外转录合成3条人IKK-αsiRNA,分别转染HLE-B3细胞,通过实时荧光定量PCR的方法检测IKK-αmRNA的表达变化,筛选出抑制效率最高的siRNA。4.采用筛选出的siRNA与优化后的转染条件对HLE-B3细胞进行转染,24h后加入TNF-α进行诱导,并分别于诱导后不同时间收集细胞及培养液,实时荧光定量PCR法检测IKK-αmRNA的表达,ELISA法检测培养液中IKK-α蛋白及下游相关因子IL-1β和TGF-β的含量。结果:1.TNF-α刺激后HLE-B3细胞胞体伸长变细,细胞形态类似成纤维细胞,细胞间“拉网现象”消失。免疫组化染色显示:正常HLE-B3细胞胞浆中即可见少量IKK-α蛋白的表达,TNF-α刺激后12h,IKK-α蛋白阳性表达量增多,且胞核染色阳性,刺激后24h、48h IKK-α蛋白表达进一步增多,染色由黄色至棕黄色。定量PCR结果显示:与正常对照组比较,TNF-α刺激后6h IKK-αmRNA表达量明显增高,刺激后24h比12h时IKK-α表达量进一步增高,其中受刺激24h后IKK-αmRNA表达量达高峰。2.实验结果显示:增加siRNA的量可以提高转染效率,但siRNA的量为10nM和25nM时转染效率无明显差异。HiPerFect 2000的剂量≤3.0μl时转染复合物的细胞毒性较小,细胞存活率可达80%以上,但是当HiPerFect 2000的剂量增加至5.0μl时,其细胞毒性显著增加。在转染混合物的组成为10nM siRNA与3.0μl HiPerFect 2000时转染效率最高达70.6%,并且仍能保证80%的细胞存活率。3.实时荧光定量PCR证实:设计并体外转录合成的3条IKK-αsiRNA转染HLE-B3细胞后,有2条能够使细胞IKK-αmRNA的表达明显减少,并且其中1条的抑制作用可以达到82%。4.定量PCR结果显示:与正常组比较,转染24h后（即加入TNF-α前）,siRNA组与TNF+siRNA组IKK-αmRNA的表达明显减少,加入TNF-α后TNF组IKK-αmRNA明显增加,TNF+siRNA组虽有增加但仍低于正常细胞水平。双抗体夹心法ELISA结果显示:各实验组的细胞培养液中IKK-α蛋白、IL-1β、TGF-B的含量变化规律与IKK-αmRNA的变化规律相一致。结论:1.应用rhTNF-α进行刺激是建立HLE-B3细胞炎症损伤模型的有效方法。2.HLE-B3细胞炎症损伤模型中IKK-α被活化并表达增加,且该因子于胞浆、胞核中表达均呈阳性,IKK-α可能是外伤障中开启炎症损伤的关键因子。3.经过转染条件的优化,转染试剂HiperFect 2000能将siRNA高效的转染进HLE-B3细胞。4.自行设计合成的IKK-αsiRNA转染进细胞后可以有效地实现对相应的内源性RNA的降解。5.利用RNA干扰（RNAi）的方法可以有效的抑制TNF-α诱导的HLE-B3细胞内IKK-α及下游因子IL-1β、TGF-β的表达上调,从而抑制对HLE-B3细胞的损伤作用。
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