慢性铅中毒对大鼠脑组织的毒性作用

论文摘要

本研究从动物整体器官组织和细胞水平上,通过病理学与生理生化相结合的方法,较系统、全面地对铅致海马有关病理和机理进行探讨。从细胞水平上用MTT法检测海马神经细胞存活率,不同浓度醋酸铅（低、中和高浓度）分别作用24h后,OD570值降低逐渐明显,呈现剂量和时间依赖关系;培养上清中乳酸脱氢酶释放明显增加（p<0.01）,胆碱酯酶活力明显下降。尼氏体染色,HE染色和Giemsa染色发现铅能使海马神经元表面粗糙、胞体变小、突起细小、回缩,断裂,甚至减少、出现裸核,细胞之间网络疏松,胞体与胞浆之间界限逐渐模糊不清,且有剂量和时间依赖关系。激光扫描共聚焦显微镜定量分析海马神经元胞浆中游离Ca2+的平均荧光强度,铅在一定浓度范围和作用时间内使海马神经元细胞内Ca2+浓度明显升高（p<0.01）,细胞内Ca2+浓度升高可能与铅致海马神经元损伤和诱导其凋亡有重要关系。流式细胞仪检测结果显示各醋酸铅组作用后细胞凋亡数量明显升高（p<0.01）,且与染铅剂量有很好的相关性。免疫细胞化学染色发现低、中、高铅组分别作用3d、6d、9d后,Bcl-2蛋白阳性的神经细胞数目显著降低,而Bax蛋白阳性的神经细胞数目显著增加; iNOS在随着铅浓度的增大,iNOS表达明显增加;醋酸铅可以促进大鼠海马细胞中P53基因的表达,并有良好的剂量反应关系。整体动物研究发现,饮用含铅水0.5 g/L、1.0 g/L和2.0 g/L（低、中和高铅组）暴露1月、3月和6月后,各实验组大鼠摄食量、饮水量逐渐减少,尤其是高铅暴露组染毒3月、6月时,平均总饮水量和平均总摄食量均显著低于对照组（p<0.01）。各组血铅水平均明显高于对照组（p<0.01）, 2.0 g/L亚组的血铅水平均明显高于组内的0.5 g/L亚组（p<0.01）,随染铅时间的延长、浓度的增加,血铅水平有所升高,但三组的组间血铅水平相比均无明显差异（p>0.05）。各组脑匀浆铅水平均明显高于对照组（p<0.05）。饮用高铅水1月、3月、和6月后各组脑区尼氏体均有不同程度的减少,神经元固缩,且与染毒时间和剂量有关。免疫组织化学染色图像分析发现,海马区Bcl-2蛋白表达阳性神经元细胞均随染铅剂量增大而减少,染色强度逐渐降低,平均灰度值逐渐增大;Bax蛋白则与Bcl-2蛋白相反。iNOS在铅处理组大鼠海马、皮层的表达明显上升,随染毒剂量增加,iNOS的表达明显增加,有良好的剂量-反应关系。大鼠脑组织海马P53表达阳性细胞数显著增加,表达强度有升高趋势;铅诱导的神经细胞凋亡与P53的表达呈正相关。综合上述研究结果,长期饮用高铅水后大鼠生长缓慢,造成慢性全身性疾病和对大鼠脑组织的破坏。高铅经体内代谢后部分通过血脑屏障,对脑实质造成损害和引起大鼠神经细胞变性,固缩及坏死;尼氏体减少,以及海马细胞凋亡等组织病理形态学改变。氧化损伤和细胞凋亡可能是铅致脑毒性的机理之一。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 铅中毒机制及其防治研究进展
• 1 铅的来源
• 2 铅中毒的危害
• 3 铅中毒的症状
• 4 铅中毒的机制
• 5 铅中毒的衡量标准
• 6 铅对海马组织的危害
• 7 铅中毒的防治
• 第二章 醋酸铅对原代培养海马神经元细胞的毒性研究
• 1、材料与方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 实验试剂
• 1.3 实验仪器
• 1.4 实验方法
• 1.4.1 原代海马细胞的培养
• 1.4.2 体外培养海马神经元鉴定
• 1.4.3 海马细胞神经元活性的测定（MTT 法）
• 1.4.4 铅对海马神经元酶活力改变
• 1.4.4.1 乳酸脱氢酶（LDH）的测定
• 1.4.4.2 胆碱酯酶（CHE）的测定
• 1.4.5 细胞凋亡的测定
• 1.4.5.1 SP 免疫组化染色
• 1.4.5.2 神经元尼氏体染色
• 1.4.5.3 常规HE 染色
• 1.4.5.4 Giemsa 染色
• 1.4.5.5 流式细胞仪检测3 种铅浓度对海马神经元的影响
• 2+浓度'>1.4.6 激光共聚焦显微镜测量海马细胞外液Ca²⁺浓度
• 2. 结果与讨论
• 2.1 培养海马细胞
• 2.1.1 神经元的分散
• 2.1.2 培养细胞的数量要适宜
• 2.1.3 抑制胶质细胞的过度增生
• 2.1.4 海马细胞模型建立
• 2.2 染毒细胞
• 2.2.1 MTT 法测定神经细胞活力
• 2.2.2 细胞尼氏体染色
• 2.2.3 HE 染色
• 2.2.4 Giemsa 染色
• 2.3 神经细胞活性
• 2.4 铅致培养上清中乳酸脱氢酶和胆碱酯酶活力改变
• 2.5 细胞凋亡的测定
• 2.5.1 细胞免疫组化
• 2.5.1.1 海马细胞Bcl-2 蛋白表达
• 2.5.1.2 海马细胞Bax 蛋白表达
• 2.5.1.3 海马细胞NOS1 蛋白表达
• 2.5.1.4 海马细胞P53 的表达
• 2.5.2 流式细胞仪检测细胞凋亡
• 2+浓度'>2.5.3 激光共聚焦显微镜测量细胞外液Ca²⁺浓度
• 3. 结论
• 第三章 慢性铅中毒动物实验模型的建立及毒性观察
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 实验试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 染铅方法
• 1.2.2 标本的采集
• 1.2.3 SP 免疫组化染色:蛋白的测定
• 1.2.4 统计学处理
• 2 结果与讨论
• 2.1 铅对大鼠的一般毒性
• 2.2 实验大鼠饮水、摄食行为改变及体重增长情况
• 2.3 血铅水平的测定各组血铅水平的变化如表1 所示
• 2.4 脑匀浆铅水平的测定各组血铅水平的变化如表2 所示
• 2.5 海马不同亚区Bcl-2 蛋白表达
• 2.6 海马不同亚区Bax 蛋白表达
• 2.7 醋酸铅对大鼠脑组织中iNOS 表达的影响
• 2.8 醋酸铅对大鼠脑组织中P53 表达的影响
• 3. 结论
• 全文结论
• 本研究创新点
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介