miR172、miR319、miR393、miR402的功能研究及转化木薯

论文摘要

MicroRNA （miRNA）是生物体内普遍存在的一种内源、非编码、小分子量的单链RNA分子,其前体具有茎-环结构。具有高度保守性、时序性和组织特异性。成熟miRNA通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对,在转录后水平介导靶mRNA降解或翻译抑制来调控基因表达。相对动物而言,植物miRNA的研究起步较晚,但由于miRNA研究技术的不断发展,新发现的植物miRNA的数量呈倍数增长。2010年9月份miRbase数据库释放了Release 16.0版本,公布3070个植物miRNA,其中双子叶植物1769个miRNA,单子叶植物887个miRNA。到目前为止,对植物miRNA的研究主要集中在基因组已被解析的拟南芥、水稻等模式植物上,而很少对非模式植物的miRNA进行研究,在miRbase数据库中还没有木薯miRNA的相关信息。本研究分析了GenBank中已公布的拟南芥中miR319、393、402和miR172的功能,将鉴定具有提高植物耐寒性功能的miRNAs转入木薯,在此基础上进一步从木薯中分离了与耐寒相关的miRNAs,结果如下：1、从拟南芥中分离了miR319c、393b、402和miR172c,并通过生物信息学预测了miR172c的20个靶基因,niR319c的14个靶基因,miR393b的8个靶基因,miR402的2个靶基因。2、构建了pVKH-35S-miR172c-pA、pVKH-35S-miR319b+402+393c-pA两种植物表达载体,并转入拟南芥中。研究发现,在长日照下,miR172高表达转基因拟南芥比野生型拟南芥提前20天开花,并且不影响植物的正常生长发育。将miR319、393、402串联高表达于拟南芥植物中,转基因拟南芥和野生型拟南芥于4℃下弱光培养40天,pVKH-35S-miR319+402+393-pA高表达转基因拟南芥除部分果夹和种子发育不正常外,表型无明显变化,而野生型拟南芥叶片大量变黄,并逐渐死亡。说明miR319、393、402串联在一起,能提高植物的耐寒性。3、本研究采用比较基因组学的方法,根据miRbase数据库中已公布的miR172、miR319、miR393、miR402序列,设计特异性引物,通过PCR获得了木薯miR172、miR319a、miR319c、miR393、miR402的前体序列,长度分别为124bp、176bp、179bp、96bp、121bp,并将其进行二级结构折叠,都可以形成发夹结构。再利用前体序列推测出miRNA的成熟序列,木薯miR172成熟序列为5’-agaaucuugaugaugcugcau-3’。木薯miR319a成熟序列为5’-uuggacugaagg gagcucccu-3’,木薯miR319c成熟序列为5’-uuggacugaagggagcuccuu-3’,木薯miR393成熟序列为5’-uccaaagggaucgcauugauc-3’,木薯miR402成熟序列为5’-uucgaggccuauuaaacctgga-3’。4、木薯是世界三大薯类作物之一,具有全年可种植、易栽培、高度耐旱、产量高等优良特性,在热带地区广为种植。但是作为典型的热带植物,温度是其生长的重要限制性因子。通过转基因技术,将pVKH-35S-miR319+402+393-pA植物表达载体转入木薯“华南8号”中,经PCR检测,得到4个阳性株系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 microRNA的发现及生物合成机制
• 1.1 microRNA的发现
• 1.2 microRNA的生物合成机制
• 1.2.1 植物miRNA的转录
• 1.2.2 植物miRNA的加工运输
• 1.2.3 植物miRNA功能沉默复合体的装配
• 1.3 microRNA的作用机制
• 1.4 microRNA与siRNA的关系
• 1.5 植物miRNA的特点
• 2 鉴定植物microRNA的方法
• 2.1 组织特异性克隆
• 2.2 生物信息学克隆和实验鉴定
• 2.3 反转录聚合酶链式反应
• 2.4 正反向遗传克隆
• 3 microRNA数据库
• 4 microRNA的功能
• 4.1 植物逆境胁迫响应miRNA
• 4.1.1 植物miRNA与生物胁迫
• 4.1.2 植物miRNA与非生物胁迫
• 4.1.2.1 miRNA与植物养分胁迫
• 4.1.2.1.1 miRNA与低氮胁迫
• 4.1.2.1.2 miRNA与低磷胁迫
• 4.1.2.1.3 miRNA与缺硫胁迫
• 4.1.2.1.4 miRNA与微量元素
• 4.1.2.2 miRNA与低温胁迫
• 4.1.2.3 miRNA与干旱胁迫
• 4.1.2.4 miRNA与高盐胁迫
• 4.2 植物miRNA对植物生长发育的影响
• 4.2.1 对根发育的影响
• 4.2.2 对叶和茎发育的影响
• 4.2.3 对花发育的影响
• 5 miRNA及其靶基因在作物遗传改良上的应用
• 6 木薯
• 6.1 木薯的基本特性
• 6.2 木薯的用途和经济价值
• 6.2.1 木薯的营养成分
• 6.2.2 木薯的加工利用
• 7 木薯再生体系建立和转基因方法综述
• 7.1 木薯再生体系建立
• 7.1.1 木薯组织培养过程中器官发生途径
• 7.1.1.1 直接器官发生途径
• 7.1.1.2 间接器官发生途径
• 7.1.2 体细胞胚胎发生途径
• 7.1.2.1 木薯初级胚状体发生
• 7.1.2.2 木薯次级体胚发生
• 7.1.2.3 脆性胚性愈伤及其悬浮培养
• 7.2 木薯遗传转化方法的研究进展
• 7.2.1 基因枪转化法
• 7.2.2 农杆菌介导法
• 7.2.2.1 农杆菌转化机理
• 7.2.2.2 农杆菌转化的优点
• 7.2.3 转基因木薯的研究进展
• 8 木薯转基因育种研究
• 8.1 抗逆方面
• 8.1.1 抗病毒转基因育种
• 8.1.2 抗除草剂基因育种
• 8.2 品质改良方面
• 8.2.1 提高蛋白质含量
• 8.2.2 降低氰化物含量
• 9 本研究的目的和意义
• 第二章 拟南芥miRNAs分离及表达载体构建
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 工具酶及试剂盒
• 1.4 主要仪器设备
• 1.5 培养基配制
• 2 方法
• 2.1 CTAB法提取拟南芥DNA
• 2.2 引物设计
• 2.3 PCR反应
• 2.4 目的片段的回收
• 2.5 目的片段和质粒的酶切、连接
• 2.5.1 酶切
• 2.5.2 连接
• 2.6 宿主菌E.coli DH5α感受态细胞的制备
• 2.7 连接产物转化大肠杆菌
• 2.8 碱裂解法提取重组质粒
• 2.9 重组子的PCR及酶切鉴定
• 2.10 植物表达载体的构建方案
• 2.10.1 pVKH-35S-miR172c-pA植物表达载体构建
• 2.10.2 pVKH-35S-miR319+402+393-pA植物表达载体构建
• 2.11 两种植物表达载体转化农杆菌LBA4404
• 2.11.1 农杆菌感受态的制备
• 2.11.2 质粒载体转化农杆菌
• 2.11.3 阳性克隆筛选与鉴定
• 3. 结果分析
• 3.1 miRNA前体克隆与序列比对
• 3.2 构建的表达载体鉴定
• 3.3 植物表达载体导入农杆菌中的鉴定
• 4. 讨论
• 第三章 miR172c、miR319c、miR393b、miR402功能鉴定及其靶基因的生物信息学预测
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 培养基配制
• 2 实验方法
• 2.1 miR172c、miR319c、miR393b、miR402靶基因的生物信息学预测
• 2.2 拟南芥培养及其管理
• 2.2.1 无菌培养基培养
• 2.2.2 拟南芥盆栽培养
• 2.2.3 拟南芥苗期管理
• 2.3 农杆菌真空转化菌液制备
• 2.4 真空渗入法转化拟南芥
• 2.5 T1代拟南芥抗性筛选及抗性苗移栽
• 2.6 拟南芥阳性转化体PCR鉴定
• 2.7 拟南芥T1代种子抗性分离比测定
• 2.8 半定量RT-PCR方法检测四种miRNA在野生和转基因拟南芥中的表达量
• 2.8.1 引物设计
• 2.8.2 总RNA提取
• 2.8.3. RT-PCR检测miRNA的表达量
• 2.8.3.1 反转录
• 2.8.3.2 PCR反应
• 2.9 miR172高表达转基因拟南芥表型变化分析
• 2.10 miR319、393、402高表达转基因拟南芥表型变化分析
• 2.11 miR319、393、402高表达转基因拟南芥的抗寒性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 转基因拟南芥植株的获得
• 3.1.1 转基因阳性植株的获得
• 3.1.2 T1代拟南芥阳性转化体的PCR鉴定
• 3.1.3 T1代种子抗性分离比测定
• 3.2 半定量RT-PCR方法检测四种miRNA在野生和转基因拟南芥中的表达量
• 3.2.1 RT-PCR检测mi172的表达量
• 3.2.2 RT-PCR检测mi319、393、402的表达量
• 3.3 172转基因拟南芥生长发育的变化
• 3.3.1 转基因拟南芥表型变化
• 3.3.2 转基因拟南芥花期的变化
• 3.3.3 miR172高表达转基因拟南芥的根长比较
• 3.3.4 产量比较
• 3.3.5 对比野生型与转基因拟南芥的生殖器官发育
• 3.4 miR319、393、402高表达转基因拟南芥生长发育的变化
• 3.4.1 转基因拟南芥表型变化
• 3.4.2 转基因拟南芥的根长比较
• 3.4.3 果荚和种子发育变化
• 3.5 抗寒实验
• 3.6 目标基因的预测
• 3.6.1 miR172c目标基因的预测
• 3.6.2 miR319c目标基因的预测
• 3.6.3 miR393b目标基因的预测
• 3.6.4 miR402目标基因的预测
• 4 讨论
• 4.1 miRNA靶基因的生物信息学预测
• 4.2 miR319、393、402对拟南芥抗寒性的影响
• 4.3 miR172过量表达对拟南芥生长发育的影响
• 4.4 miR319、393、402过量表达对拟南芥生长发育的影响
• 第四章 miR319c、miR393b、miR402融合转化木薯的研究
• 1. 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 植物激素和抗生素
• 1.3 植物培养基
• 2 方法
• 2.1 无菌苗的获得和再生体系的建立
• 2.1.1 实生苗的消毒
• 2.1.2 再生体系的建立
• 2.2 木薯子叶胚受体系统建立
• 2.2.1 建立过程
• 2.2.2 膨大腋芽的获得
• 2.2.3 初级体细胞胚的诱导
• 2.2.4 木薯胚状体的成熟
• 2.2.5 木薯子叶胚茎器官发生
• 2.2.5.1 6-BA对木薯子叶胚茎器官发生的影响
• 2.2.5.2 抗菌素羧苄青霉素Car浓度的确定
• 2.3 农杆菌介导的子叶胚转化法
• 2.3.1 外植体的获得
• 2.3.2 侵染菌液获得
• 2.3.3 共培养时间
• 2.3.4 农杆菌的清洗
• 2.3.5 潮霉素筛选
• 2.3.6 抗性苗的获得
• 2.4 转基因植物PCR分子序列检测的方法
• 2.4.1 植物总DNA的提取（CTAB法）
• 2.4.2 PCR检测
• 2.4.3 目的片段的回收
• 2.4.4 目的片段连接T-Vector
• 2.4.5 连接产物的转化
• 2.4.6 送样测序
• 3 结果与分析
• 3.1 体细胞胚的诱导
• 3.1.1 毒莠定对体细胞胚胎发生的影响
• 3.1.2 次级胚状体的发生
• 3.2 不同6-BA浓度对胚状体成熟的影响
• 3.3 木薯子叶胚茎器官发生
• 3.4 木薯子叶胚茎伸长培养基的确定
• 3.5 农杆菌介导的转化的结果分析
• 3.6 抗菌素羧苄青霉素浓度
• 3.7 筛选压实验
• 3.8 抗性苗的获得
• 3.9 转基因植株的PCR序列检测结果分析
• 4 讨论
• 4.1 胚状体诱导
• 4.2 木薯遗传转化中的影响因素
• 4.3 抗寒转基因木薯的发展前景
• 第五章 木薯中miR172、miR319、miR393、miR402的RT-PCR鉴定及前体的克隆与结构分析
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 木薯miR172、319、393、402的RT-PCR鉴定
• 2.1.1 引物设计
• 2.1.2 木薯总RNA的提取
• 2.1.3 RT-PCR鉴定
• 2.1.3.1 反转录
• 2.1.3.2 PCR反应
• 2.2 木薯miR172、319、393、402前体的克隆、测序和结构分析
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 CTAB法提取木薯总DNA
• 2.2.3 克隆和测序
• 2.2.4 目的片段的回收
• 2.2.5 连接产物的转化
• 2.2.5.1 目的片段和T-Vector的连接
• 2.2.5.2 连接产物的转化
• 2.2.5.3 送样测序
• 2.2.6 miRNA前体二级结构折叠及成熟序列预测
• 2.2.7 miRNA同源性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 木薯miR172、miR319、miR393、miR402表达的RT-PCR鉴定
• 3.1.1 总RNA提取
• 3.1.2 RT-PCR鉴定
• 3.2 木薯miR172、319、393、402前体克隆及测序
• 3.3 木薯miR172、319、393、402前体二级结构及成熟序列
• 3.3.1 木薯miR172前体二级结构及成熟序列
• 3.3.2 木薯miR319前体二级结构及成熟序列
• 3.3.3 木薯miR393前体二级结构及成熟序列
• 3.3.4 木薯miR402前体二级结构及成熟序列
• 3.4 同源分析
• 3.4.1 木薯miR172与其它物种同源分析
• 3.4.2 木薯miR319与其它物种同源分析
• 3.4.3 木薯miR393与其它物种同源分析
• 3.4.4 木薯miR402与其它物种同源分析
• 3 讨论
• 第六章 研究结论
• 参考文献
• 致谢