伪狂犬病毒Ea株主要衣壳蛋白之间的相互作用研究

论文摘要

伪狂犬病（Pseudorabies）又称奥耶斯基氏病（Aujeszky’s disease,AD）,是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。伪狂犬病毒基因组全长约150kb,可编码70-100种蛋白,与α-疱疹病毒亚科的其它成员一样,PRV具有潜伏感染和神经嗜性等特征。PRV病毒粒子结构与其它疱疹病毒相似,成熟的病毒粒子由四种结构组成:中心的核含有病毒的线性双链DNA基因组,DNA被包裹在起保护作用的二十面体衣壳中形成核衣壳,衣壳再嵌入到间质结构中,最终在间质外包裹囊膜。几乎PRV所有基因产物的一半都是成熟病毒粒子的结构成分。目前,关于PRV衣壳蛋白的研究都是从HSV-1病毒粒子的研究中推测出来的,推测PRV的衣壳为二十面体结构（150个六邻体和12个五邻体）。其中六邻体含有6个UL19分子和6个UL35分子,形成衣壳边缘和表面;12个五邻体形成衣壳顶角,有11个五邻体是UL19的五聚物,仅第12个顶角是由12个UL6分子形成的圆柱形结构,仅允许一个拷贝的病毒DNA基因组进入衣壳。因此,每一个成熟的衣壳含有955个UL19（VP5）分子、900个UL35（VP26）分子、640个UL18分子（VP23）、320个UL38分子（VP19C）和12个UL6分子（接入蛋白）。衣壳在细胞核中装配,需要六种成熟衣壳的蛋白（UL38、UL35、UL25、UL19、UL18、UL6）和两种框架蛋白（UL26、UL26.5）,这两种框架蛋白参与形成衣壳但并不存在于成熟的衣壳中。鉴于以上研究背景,本研究对于PRV衣壳的形成的机制,衣壳的包装、成熟和稳定进行了探索,研究了衣壳蛋白之间的相互作用。主要研究内容如下:1.PRV Ea株UL6、UL18、UL19、UL25、UL26、UL26.5、UL35、UL38的克隆以及序列分析以伪狂犬病毒Ea株基因组DNA为模板,分别PCR扩增UL6、UL18、L25、UL26、UL26.5、UL35、UL38,克隆到pMD18-T载体,并测序。测序结果表明Ea株UL6、UL18、L25、UL26、UL26.5、UL35、UL38基因全长分别为1938bp、891bp、1605bp、1599bp、861bp、312bp、1107bp,分别编码646、297、535、533、287、104、369个氨基酸,与PRV Ka株核苷酸同源性分别为98%、98%、99%、97%、95%、99%、98%,氨基酸同源性分别为97%、98%、99%、97%、95.8%、99%、99%。UL19采用分段克隆,扩增UL19上游368bp,下游600bp的碱基,并酶切PRVEa基因组,回收BamHⅠ第4片段,并进一步酶切构建重组质粒,获得pShuttle-UL19。2.PRV Ea株衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及亚细胞定位分析将UL6克隆到原核表达载体pET-28a,获得原核表达质粒pET-28a-UL6,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导3h后,经12%SDS-PAGE和Western印迹分析在70kDa处出现一条特异性杂交带,表明融合蛋白6×His-UL6具有良好的反应活性。同理,分析融合蛋白6×His-UL18大小为33kDa,GST-UL26.5为56kDa,6×His-UL38为40kDa。进一步将UL6基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-C2,获得真核重组表达质粒pEGFP-UL6。同理,构建pEGFP-UL18、pEGFP-UL19、pEGFP-UL25、pEGFP-UL26、pEGFP-UL26.5、pEGFP-UL35和pEGFP-UL38,并将获得的表达质粒分别转染HeLa细胞,在转染后48h通过激光共聚焦显微镜观察荧光,结果显示对照质粒pEGFP-C2转染的细胞在整个细胞中都可见弥散型的绿色荧光分布,且在转染后一直呈弥散型分布;融合蛋白EGFP-UL6定位于细胞质,EGFP-UL18、EGFP-UL26.5以及EGFP-UL38在转染后48h几乎完全定位于细胞核内,而EFGP-UL19、EGFP-UL25、EGFP-UL26、EGFP-UL35转染后一直没有明显的变化,呈弥散型分布。3.哺乳动物双杂交检测PRV Ea株衣壳蛋白基因之间的相互作用pMD-UL18经BamHⅠ和KpnⅠ酶切后,分别插入哺乳动物双杂交表达载体pACT与pBIND的相同酶切位点,获得重组pACT-UL18与pBIND-UL18,同理获得pACT-UL19等14个重组质粒。将pACT分别与pBIND、pBIND-UL6、pBIND-UL18、pBIND-UL19、pBIND-UL25、pBIND-UL26、pBIND-UL26.5、pBIND-UL35、pBIND-UL38:pBIND分别与pACT-UL6、pACT-UL18、pACT-UL19、pACT-UL25、pACT-UL26、pACT-UL26.5、pACT-UL35、pACT-UL38共转染CHO细胞,48h后收集细胞,裂解后采用双荧光报告系统检测,结果显示pACT与pBIND-UL19,pACT与pBIND-UL25,pBIND与pACT-UL26.5存在自激活。根据自激活结果,将构建的哺乳动物双杂交表达质粒两两之间共转染CHO细胞,48h收集细胞,用裂解液充分裂解后双荧光报告系统检测荧光素比值,结果显示UL18与UL38,UL19与UL26.5,UL26.5与UL26之间存在相互作用。4.GST Pull-Down和免疫共沉淀试验验证PRV Ea株衣壳蛋白的相互作用将大肠杆菌表达的UL26.5蛋白与重组杆状病毒rBacUL19感染Sf9细胞48h收集的裂解液,采用GST Pull-Down验证,显示在140kDa可以看见一条特异性条带,是重组杆状病毒rBacUL19的表达产物,说明UL19与UL26.5之间存在相互作用。构建哺乳动物表达质粒pCMV-HA-UL18、pCMV-Myc-UL18、pCMV-HA-UL38以及pCMV-Myc-UL38,将HA-UL18与Myc-UL38,以及HA-UL38与Myc-UL18在脂质体介导下共转染HeLa细胞,48h后裂解细胞,免疫印迹分析UL18与UL38的作用,在HA-UL18与Myc-UL38共转染的细胞裂解液,用HA多抗沉淀的产物,使用Myc单抗可以检测到UL38的表达;而在HA-UL38与Myc-UL18共转染的细胞裂解液,用HA多抗沉淀的产物,使用Myc单抗可以检测到UL18的特异性表达条带,验证UL18与UL38之间存在相互作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词表（ABBREVIATION）
• 第1章 文献综述
• 1.1 病毒的分类
• 1.1.1 病毒的命名
• 1.1.2 疱疹病毒和α-疱疹病毒
• 1.2 PRV的分子生物学
• 1.2.1 病毒粒子的结构
• 1.2.2 基因组和基因产物
• 1.2.3 衣壳蛋白
• 1.2.4 间质蛋白
• 1.2.5 囊膜蛋白
• 1.2.6 在PRV感染过程中宿主转录的改变
• 1.2.7 在潜伏期的基因表达
• 1.2.8 DNA复制
• 1.2.9 核酸代谢
• 1.2.10 衣壳的形成
• 1.2.11 环氧化酶和衣壳装配
• 1.2.12 DNA衣壳化
• 1.3 PRV作为一种模式病毒
• 1.4 伪狂犬病对家畜的影响
• 1.4.1 历史上的发现
• 1.4.2 在非自然宿主中伪狂犬病感染的致死性
• 1.4.3 PRV对猪的急性感染
• 1.4.4 PRV在猪体内的潜伏
• 1.4.5 修饰的活疫苗
• 1.4.6 DNA疫苗
• 1.4.7 PRV的诊断试验
• 1.4.8 伪狂犬病的世界分布
• 1.5 哺乳动物双杂交的研究进展
• 1.5.1 哺乳动物双杂交的原理
• 1.5.2 杂交新的发展
• 1.5.3 杂交技术新的应用
• 1.6 杆状病毒简介
• 1.6.1 杆状病毒表达系统的研究
• 1.6.2 杆状病毒作为哺乳动物细胞表达载体的研究
• 第2章 研究目的和意义
• 第3章 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 病毒、细胞和菌株
• 3.1.2 载体与质粒
• 3.1.3 工具酶及主要试剂
• 3.1.4 主要培养基及其配制
• 3.1.5 缓冲液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 PRV的增殖
• 3.2.2 PRV基因组DNA提取
• 3.2.3 PRV衣壳基因的PCR扩增
• 3.2.4 PCR或酶切产物的回收与纯化
• 3.2.5 线性质粒DNA末端去磷酸化
• 3.2.6 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
• 3.2.7 大肠杆菌感受态细胞制备
• 3.2.8 连接产物的转化
• 3.2.9 质粒的小量制备
• 3.2.10 质粒的大量制备
• 3.2.11 质粒DNA的定量
• 3.2.12 重组质粒（阳性质粒）的鉴定
• 3.2.13 诱导表达
• 3.2.14 SDS-PAGE电泳
• 3.2.15 Western blotting
• 3.2.16 脂质体介导的共转染
• 3.2.17 双荧光素酶检测转染基因的相互基因
• 3.2.18 统计方法
• 3.2.19 GST Pull-Down
• 3.2.20 免疫共沉淀
• 3.2.21 重组杆状病毒的构建流程
• 第4章 结果与分析
• 4.1 PRV Ea株衣壳蛋白基因的克隆与序列分析
• 4.1.1 PRV Ea株UL19基因的克隆与序列分析
• 4.1.2 PRV Ea株UL6基因的克隆与序列分析
• 4.1.3 PRV Ea株UL18基因的克隆与序列分析
• 4.1.4 PRV Ea株UL25基因的克隆与序列分析
• 4.1.5 PRV Ea株UL26基因的克隆与序列分析
• 4.1.6 PRV Ea株UL26.5基因的克隆与序列分析
• 4.1.7 PRV Ea株UL35基因的克隆与序列分析
• 4.1.8 PRV Ea株UL38基因的克隆与序列分析
• 4.2 PRV Ea株主要衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达与检测
• 4.2.1 PRV Ea株主要衣壳蛋白原核表达质粒的构建
• 4.2.2 PRV Ea株衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达与检测
• 4.3 PRV Ea株衣壳蛋白在HeLa细胞中的表达与定位分析
• 4.3.1 PRV Ea株衣壳蛋白真核表达质粒的构建
• 4.3.2 PRV Ea株衣壳蛋白真核表达质粒在HeLa细胞中的表达
• 4.4 哺乳动物双杂交检测PRV Ea株衣壳蛋白的相互作用
• 4.4.1 哺乳动物双杂交表达质粒的构建
• 4.4.2 哺乳动物双杂交表达质粒转染细胞后双荧光检测
• 4.5 GST Pull-Down验证衣壳蛋白UL19与UL26.5之间的相互作用
• 4.5.1 原核表达质粒pGEX-UL26.5的构建与鉴定
• 4.5.2 UL26.5基因在大肠杆菌中的表达
• 4.5.3 转作质粒pFastBac HT-UL19与重组杆状病毒rBacmid-UL19的构建
• 4.5.4 重组杆状病毒rBacUL19表达产物的SDS-PAGE检测
• 4.5.5 UL26.5与UL19相互作用的检测
• 4.6 免疫共沉淀验证衣壳蛋白之间的相互作用
• 4.6.1 哺乳动物表达质粒的构建
• 4.6.2 免疫共沉淀
• 第5章 讨论与结论
• 5.1 讨论
• 5.1.1 PRV Ea株主要衣壳蛋白基因的克隆
• 5.1.2 PRV Ea株衣壳蛋白基因的表达以及在HeLa细胞中的定位
• 5.1.3 伪狂犬病毒衣壳的装配
• 5.1.4 哺乳动物双杂交体系的选择
• 5.1.5 PRV Ea株衣壳蛋白的相互作用
• 5.2 结论
• 参考文献
• 致谢