我国养殖太平洋牡蛎中诺瓦克样病毒的检测及部分核酸序列的分析

论文摘要

诺瓦克样病毒（Norwalk-like viruses, NLVs）是一组形态和生物学特征类似的无包膜的正的单链RNA病毒的统称。其形态微小,圆形,直径为26-35nm,属于杯状病毒科。根据病毒RNA聚合酶区或衣壳蛋白核苷酸和氨基酸序列的同源性比较,将NLVs分为3个基因组:基因Ⅰ组（代表株NV）、基因Ⅱ组（代表株SMA）、Sapporo virus。美国联邦疾病控制中心（Centers for Disease Control and Prevention, CDC）对1976-1980年腹泻流行的调查报告表明约有42%的胃肠炎暴发与NLVs有血清学联系。NLVs能耐受不良的外界环境、感染持续时间长,且仅10-100个病毒粒子就能引起感染,所以说它的危害性不可低估。我国1995年从患儿的粪便标本中发现了第一例NLVs。靖宇等人曾经应用免疫酶联技术从北京市医院门诊非细菌性腹泻病人的血清标本中检测到NLVs,广州也有生食NLVs污染的蟹肉引发的急性胃肠炎的报道,这都说明在我国NLVs是存在的。美国和日本已报道了大量由于生吃贝类食物而暴发的NLVs感染引起的流行性胃肠炎。我国是水产品大国,每年都养殖大量的贝壳类水产品,尤其牡蛎是我国第一大养殖贝类,产量居贝类首位。每年我国都会向日本等国出口大量的牡蛎,此外在我国江浙沿海地区,人民喜欢生食贝类等海产品。因而建立一种快速的检测方法,一方面可以避免疾病的发生,保护人们的健康,另一方面,也可以监控出口海产品的质量。 到目前为止国内还没有关于检测养殖牡蛎中诺瓦克样病毒存在情况的相关报道。本论文利用pH9.5的甘氨酸缓冲液性处理牡蛎匀浆液,PEG沉淀病毒粒子的方法对未知的是否污染有诺瓦克样病毒的牡蛎样品进行处理,并提取病毒RNA,进行RT-PCR法对37份牡蛎样品进行了检测,共检测到6个阳性样品。从2002年11月到2003年4月份这一期间内所采集的牡蛎样品中,分离出的NLVs最多,说明冬天为牡蛎污染NLVs的高峰期。对于其中的粪便阳性样品和牡蛎分离样品的PCR产物进行纯化、连接及转化,获取重组克隆并测序。重组质粒序列测定结果在NCBI上进行BLASTn序列比对发现这些病毒分离株均属于GⅡ型。且与GeneBank上的日本株的同源性较高（>94%）。这说明了地理关系上

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要（Abstract）
• 第一节 文献综述
• 1. 病毒特征和其基因组结构
• 1.1 病毒的分类
• 1.2 形态学特征
• 1.3 NLVs病毒的理化特性
• 1.4 基因组结构和分类
• 1.5 基因组的遗传和变异
• 1.6 病毒的繁殖
• 2. 病毒的致病机制和临床症状
• 2.1 致病机制
• 2.2 临床症状
• 2.3 发病率
• 3. 传播途径
• 4. 诺瓦克病毒性腹泻的预防与控制
• 5. NLVs的检测分析方法
• 5.1 电镜法
• 5.1.1 直接电镜法
• 5.1.2 免疫电镜法
• 5.1.3 固相免疫电镜法
• 5.2 免疫吸附凝集试验（IAHA）
• 5.3 放射免疫试验（RIA）
• 5.4 酶联免疫试验（ELISA）
• 5.5 Western杂交法
• 5.6 RT-PCR法
• 5.6.1 病毒的分离方法
• 5.6.2 核酸提取方法
• 5.6.3 引物的选择
• 5.7 核酸杂交法
• 5.8 荧光定量PCR
• 5.8.1 SYBR荧光染料
• 5.8.2 Taqman技术
• 5.9 序列特异性核酸体外扩增技术
• 6. 论文的研究目的和研究方法
• 第二节 RT-PCR法检测太平洋牡蛎中的诺瓦克样病毒和病毒RNA聚合酶区部分序列的分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.12 牡蛎的处理及病毒核酸的提取
• 2.1.3 核酸扩增
• 2.1.4 PCR产物纯化、克隆及测序
• 2.1.5 PCR产物纯化、克隆及测序
• 2.1.5.1 感受细胞的制备
• 2.1.5.2 PCR产物的纯化及克隆
• 2.2 试验结果
• 2.2.1 扩增诺瓦克样病毒RNA聚合酶区基因片段的引物的选择
• 2.2.2 重组质粒的测序结果和序列分析
• 2.2.2.1 粪便分离株和牡蛎分离株的序列比对和系统树分析
• 2.2.2.2 与其他病毒分离株RNA聚合酶区序列的比对和系统树分析
• 2.3 讨论
• 第三节 寡核苷酸斑点杂交法对RT-PCR结果的验证
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 试验样品的编号
• 3.1.3 试剂的配制方法
• 3.1.4 寡聚核苷酸杂交探针的设计
• 3.1.5 寡核苷酸探针杂交试验
• 3.1.6 灵敏度试验
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 质粒及RT-PCR产物的杂交结果
• 3.2.2 灵敏度试验
• 3.3 讨论
• 第四节 Taqman荧光定量PCR对NLVs分离株的检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试验方法
• 4.1.2.1 核酸的提取
• 4.1.2.2 引物与探针的设计
• 4.1.2.3 TaqmanPCR反应体系
• 4.2 试验结果
• 4.2.1 对NLVsGⅡ病毒核酸RNA的real-time PCR
• 4.2.2 NLVsGⅠ和NLVsGⅡ的荧光定量标准曲线的建立
• 4.2.3 其他样品结果（NLVsGⅡ）
• 4.2.4 与常规PCR检测限的比较（NLVsGⅡ）
• 4.3 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢