放线菌有序基因组文库的构建和应用及遗传因子的研究

放线菌有序基因组文库的构建和应用及遗传因子的研究

论文摘要

放线菌(actinomycetes)属于革兰氏阳性细菌中的高G+C%类群,具有复杂的发育和分化生长周期,产生大约8700种抗生素和生理活性物质,并拥有独特的遗传特征,是微生物领域基础和应用研究的一个重要材料。本文以重要应用价值的除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)和尤马马杜拉放线菌(Actinomadura yumaensis)、模式链霉菌—天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、有独特染色体外遗传因子的链霉菌44414和诺卡氏菌(Nocardia)107等为材料,开展了功能基因组、抗生素生物合成和DNA复制等方面的研究。具体结果包括:1有序排列的S. avermtitilis基因组文库的构建及多拉菌素(Doramectin)基因工程菌株的获得。以柯斯质粒SuperCos1为载体,构建了除虫链霉菌的基因组文库。对约1000个柯斯质粒上插入片段的两端进行测序,并利用全基因组序列的信息,构建了覆盖约91%基因组的有序排列的柯斯文库。利用λRED高效DNA重组和大肠杆菌-链霉菌接合转移技术,建立了除虫链霉菌的基因组遗传操作系统。可以在该菌中进行高效、精确的基因或基因簇的敲除工作,还能够进行连续的基因缺失研究。运用该系统对几个除虫链霉菌工业生产菌株的次生代谢途径和代谢流向进行了改良,首次获得了遗传改造的可以产生多拉菌素的基因工程菌株。此外,发现aveD和aveF之间可能存在一个前人忽视的基因,发现aveC基因可能直接参与Avermectin的生物合成。2利用抗生素生物合成正调控基因改造Avermectin和Doramectin的工业生产菌。通过将在模式链霉菌中发现的afsR、aveR、orfX、afsB、cprB、metK等调控基因导入到S. avermtitilis的产生Avermectin工业菌株和Doramectin的突变菌株,发现3种调控基因afsR,aveR和orfX对菌株MMR630阿维菌素的产量均可以提高约1倍。但是,以上的3种,加上另外3种调控基因,分别导入菌株G11后,发现除afsB提高约13%外,其余调控基因使菌株多拉菌素的产量反而有不同程度的降低。将调控基因afsB置于链霉菌强启动子permE*下表达降低了菌株G11中多拉菌素的含量。这些结果表明,调控基因对于不同链霉菌的抗生素生物合成具有不同的影响,反映了抗生素生物合成确实受到了复杂网络的调控。3利用新型载体构建基因组文库以进行DNA大片段的敲除。为了对链霉菌基因组进行DNA大片段的敲除,构建了新型的柯斯载体pHAQ31。利用该载体构建了S. avermitilis和S. coelicolor的有序排列的基因组文库,覆盖率分别为73%和62%。利用这二个文库除了可以进行精确的λRED介导的基因替换敲除外,还可以进行DNA大片段的敲除。在S. avermitilis中,利用该系统不带抗性标记,敲除30kb片段的效率可达10%以上。利用该体系尝试了S. coelicolor多个染色体大片段敲除。利用pHAQ31和SuperCos1构建的两套S. avermtitilis基因组文库,构建了敲除S.avermtitilis的除Avermectin合成以外9个聚酮类抗生素生物合成基因簇载体,并完成了部分8基因簇的敲除工作。4马杜拉霉素(Maduramicin)生物合成基因簇中聚酮合成相关基因片段的克隆。以pHZ1358为载体构建了马杜拉霉素产生菌A. yumaensis的基因组文库。利用从该菌中克隆到的内源探针,对基因组文库筛选获得了9个阳性克隆,通过阳性克隆的两端测序分析,发现4个克隆两侧显示出与聚酮合成酶高度同源,推测可能和马杜拉霉素的生物合成相关。5链霉菌温度敏感性线型质粒pRL4的复制功能研究。链霉菌44414携带3个内源线型质粒,在40度培养条件下,其中pRL4质粒发生丢失(温度敏感性)。通过部分酶切和克隆鉴定了pRL4的基本复制区域,由一个与S. avermtilis中线型质粒SAP1相似的新的基因和一段非编码区组成。通过比较鉴定了S.avermtilis中线型质粒SAP1的中心基本复制区。6诺卡氏菌环型质粒pXT107的复制研究。在Nocardia sp. 107中发现质粒pXT107是诺卡氏菌属中报道的最小的环型质粒之一,由4335bp组成。序列分析及功能研究显示,该质粒具有典型的滚环复制质粒的特征。构建的大肠杆菌—诺卡氏菌穿梭质粒pHAQ22能够在N. corallina 4.1037中复制,但不能在变青链霉菌(S.lividans)中复制。7 A. yumaensis染色体基本复制区的克隆及分析。利用根据dnaA和dnaN保守序列设计的简并引物在马杜拉放线菌中扩增到1.3kb片段。研究发现,尤马马杜拉放线菌染色体复制区位于保守基因dnaA与dnaN之间,包含919碱基对。与已发表的3个属的放线菌染色体oriC序列的特征不同,尤马马杜拉放线菌的染色体oriC含有14个DnaA盒子和2个AT富含区,DnaA盒子的保守序列是(T/C)(T/C)GTCC(A/C)CA。携带该oriC片段的大肠杆菌质粒可以在天蓝色链霉菌中复制和以低拷贝方式遗传。比较来自放线菌4个属的oriC,发现以oriC序列和以16S rDNA序列构建的进化树十分相似,进一步支持了前人的推测。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表
  • 第一章 前言
  • 1 放线菌概述
  • 2 放线菌基因组研究
  • 2.1 放线菌基因组测序
  • 2.2 天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)基因组
  • 3 放线菌遗传因子及其复制
  • 3.1 放线菌染色体的复制
  • 3.2 放线菌线型质粒的复制
  • 3.3 放线菌环型质粒的复制
  • 3.3.1 滚环复制(rolling circle replication,RCR)质粒
  • 3.3.2 θ复制质粒
  • 4 除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)及其阿维菌素(Avermectin)
  • 4.1 除虫链霉菌概述
  • 4.2 阿维菌素的生物合成
  • 4.2.1 阿维菌素的生物合成途径
  • 4.2.2 阿维菌素的生物合成基因簇
  • 4.2.2.1 阿维菌素生物合成突变株
  • 4.2.2.2 阿维菌素的生物合成基因簇
  • 4.2.2.3 阿维菌素生物合成基因功能
  • 4.3 除虫链霉菌基因组
  • 4.4 阿维菌素次生代谢工程研究进展及存在的问题
  • 4.4.1 阿维菌素生物合成的结构基因的改造
  • 4.4.2 阿维菌素生物合成调节基因的改造
  • 5 尤马马杜拉放线菌(Actinomadura yumaensis)及其马杜拉霉素
  • 5.1 马杜拉霉素的基本性质
  • 5.2 马杜拉霉素的生物合成
  • 6 放线菌的次生代谢工程的策略
  • 6.1 改善限速步骤的基因
  • 6.2 操纵调节基因
  • 6.3 增加抗性基因的拷贝数
  • 6.4 异源表达抗生素生物合成基因
  • 6.5 阻断支路代谢,增加目标产物的产量
  • 6.6 沉默基因(Silent genes)的表达
  • 6.7 突变生物合成
  • 6.8 组合生物合成
  • 6.9 引进组合抗性基因突变
  • 6.10 代谢流控制
  • 7 本论文研究的目的及其意义
  • 7.1 有序排列的放线菌基因组文库的构建及应用
  • 7.1.1 除虫链霉菌基因组文库的构建及应用
  • 7.1.2 利用正调控基因进行除虫链霉菌次生代谢工程的研究
  • 7.1.3 天蓝色链霉菌有序基因组文库的构建及应用
  • 7.1.4 马杜拉霉素产生菌的基因组文库的构建及应用
  • 7.2 放线菌遗传因子的研究
  • 7.2.1 链霉菌温敏线型质粒pRL4复制区的鉴定
  • 7.2.2 诺卡氏菌小环型质pXT107的研究
  • 7.2.3 尤马马杜拉放线菌染色体基本复制区克隆
  • 第二章 材料与方法
  • 1 材料
  • 1.1 菌株
  • 1.2 质粒
  • 1.3 培养基
  • 1.3.1 液体培养基
  • 1.3.2 固体培养基
  • 1.3.3 发酵培养基
  • 1.4 抗生素
  • 1.5 酶和生化试剂
  • 2 方法
  • 2.1 大肠杆菌(Escherichia coli)质粒提取
  • 2.1.1 快速小量制备质粒DNA
  • 2.1.2 大肠杆菌转化子的快速检测
  • 2.2 大肠杆菌转化
  • 2+法感受态细胞的制备及转化'>2.2.1 E.coli的Ca2+法感受态细胞的制备及转化
  • 2.2.2 E.coli电击感受态细胞的制备转化
  • 2.2.3 λRED介导PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化
  • 2.3 放线菌培养
  • 2.3.1 放线菌孢子悬液的制备
  • 2.3.2 放线菌孢子的预萌发
  • 2.4 阿维菌素的发酵及检测
  • 2.4.1 发酵培养
  • 2.4.2 发酵产物组分含量测定
  • 2.5 放线菌DNA的提取
  • 2.5.1 放线菌环型质粒DNA的少量抽取
  • 2.5.2 放线菌基因组DNA的大量抽提
  • 2.5.3 放线菌基因组DNA少量抽提
  • 2.6 放线菌DNA的遗传转化
  • 2.6.1 原生质体制备
  • 2.6.2 用质粒DNA转化链霉菌的原生质体(初始方法)
  • 2.6.3 用质粒DNA转化链霉菌的原生质体(小规模快速方法)
  • 2.6.4 大肠杆菌与放线菌间的接合转移操作流程
  • 2.6.5 放线菌电转化感受态细胞的制备及其电转化
  • 2.7 DNA体外操作
  • 2.7.1 限制性核酸内切酶酶切DNA
  • 2.7.2 DNA去磷酸化
  • 2.7.3 DNA3’凹端补平和3’突出端的去除
  • 2.7.4 DNA体外连接反应
  • 2.7.5 DNA的PCR扩增反应
  • 2.7.6 基因组DNA部分酶切及回收
  • 2.7.6.1 部分酶切条件的建立
  • 2.7.6.2 大规模制备部分酶切的基因组DNA
  • 2.7.6.3 基因组DNA片段的大小分部(Size fractionation)
  • 2.8 柯斯(cosmid)文库的构建
  • 2.8.1 柯斯文库构建流程
  • 2.8.2 柯斯质粒载体的准备
  • 2.8.3 连接体系的建立
  • 2.8.4 连接混合物的包装及文库转染
  • 2.8.5 柯斯质粒基因组文库质量检测
  • 2.9 琼脂糖凝胶电泳(Sambrook and Russell ,2001)
  • 2.9.1 普通琼脂糖凝胶电泳
  • 2.9.2 脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis)
  • 2.9.2.1 脉冲电泳样品制备
  • 2.9.2.2 脉冲场电泳样品酶切
  • 2.9.2.3 脉冲场电泳操作
  • 2.10 琼脂糖凝胶中目的DNA片段的回收
  • 2.10.1 柱回收法
  • 2.10.2 琼脂糖酶法
  • 2.11 DNA杂交技术
  • 2.11.1.1 DNA向尼龙膜的毛细管转移
  • 2.11.1.2 同位素标记DNA探针
  • 2.11.1.3 DNA杂交实验
  • 2.11.2 菌落原位杂交(colony in situ hybridization)
  • 2.11.2.1 菌落DNA释放及固定
  • 2.11.2.2 菌落原位杂交
  • 第三章 结果与分析
  • 第一节 有序排列的基因组文库的构建及其应用
  • 1 除虫链霉菌有序排列的基因组文库的构建及其应用
  • 1.1 基因组DNA的提取
  • 1.2 利用柯斯载体SuperCosl构建基因组文库
  • 1.2.1 基因组DNA的部分酶切
  • 1.2.2 基因组文库的构建及质量检测
  • 1.3 有序排列的基因组文库的获得
  • 1.4 有序排列的基因组文库的应用
  • 1.4.1 建立高效基因替换策略
  • 1.4.2 高效基因替换的实施
  • 1.4.3 抗生素次生代谢工程
  • 1.4.4 抗生素生物合成结构基因的研究
  • 1.4.5 抗生素生物合成调控基因功能的研究
  • 1.5 小结
  • 2 利用正调控基因改造阿维菌素和多拉菌素(Doramectin)产生菌
  • 2.1 正调控基因的获得
  • 2.2 正调控基因导入除虫链霉菌并测定稳定性
  • 2.3 正调控基因的效果检测
  • 2.3.1 调控基因afsR,aveR和orfX均对阿维菌素的工业生产菌株MMR630中Bla组分产量的影响
  • 2.3.2 多种调控基因中对多拉菌素工业生产菌株G11的产量的影响
  • *的调控基因afsB降低了工业生产菌株G11中多拉菌素的含量'>2.4 带有强启动子perm E*的调控基因afsB降低了工业生产菌株G11中多拉菌素的含量
  • 2.5 小结
  • 3 利用新型柯斯载体构建有序排列的天蓝色链霉菌和除虫链霉菌的基因组文库
  • 3.1 链霉菌基因组DNA的抽提
  • 3.2 基因组文库的构建
  • 3.2.1 基因组DNA部分酶切
  • 3.2.2 文库的构建及质量检测
  • 3.2.3 有序排列的基因组文库的获得
  • 3.3 新型柯斯载体pHAQ31构建的二个基因组文库及其应用
  • 3.3.1 高效基因敲除策略
  • 3.3.2 除虫链霉菌基因组文库的构建及其基因组大片段DNA敲除
  • 3.3.3 天蓝色链霉菌有序文库的构建及其基因簇敲除
  • 3.4 组合pHAQ31和SuperCos1构建的除虫链霉菌基因组文库进行基因组大片段DNA敲除
  • 3.5 小结
  • 4 尤马马杜拉放线菌基因组文库的构建及马杜拉霉素生物合成基因簇的克隆
  • 4.1 尤马马杜拉放线菌基因组DNA的抽提
  • 4.2 基因组文库的构建
  • 4.2.1 基因组DNA的部分酶切
  • 4.2.2 基因组文库的构建
  • 4.3 尤马马杜拉放线菌内源聚酮合成酶探针的获得
  • 4.4 聚酮合成酶及酰基转移酶探针菌落杂交筛选生物合成相关的阳性克隆
  • 4.5 阳性克隆两端测序结果
  • 4.6 小结
  • 第二节 放线菌遗传因子复制的研究
  • 1 链霉菌44414(Streptomyces sp.44414)中温敏性线型质粒pRL4的研究
  • 1.1 pRL4温敏性检测
  • 1.2 pRL4复制区的克隆及序列分析
  • 1.3 pRL4复制区的序列分析
  • 1.4 pRL4最小复制区的鉴定
  • 1.5 pRL4最小复制区的分析及线型质粒SAP1中心复制区的研究
  • 1.6 小结
  • 2 诺卡氏菌环型质粒pXT107研究
  • 2.1 pXT107的分离及克隆
  • 2.2 pXT107的序列分析
  • 2.3 pXT107的复制功能分析
  • 2.4 小结
  • 3 尤马马杜拉放线菌染色体的复制起始区(oriC)克隆
  • 3.1 染色体复制区的克隆
  • 3.2 染色体复制区的序列分析
  • 3.3 染色体复制区的功能研究
  • 3.4 染色体oriC的进化树分析
  • 3.5 小结
  • 第四章 讨论
  • 参考文献
  • 发表文章目录
  • 致谢
  • 相关论文文献

    • [1].福尔马林固定石蜡包埋样本全基因组文库构建流程优化[J]. 中华临床实验室管理电子杂志 2020(02)
    • [2].深海沉积物微生物元基因组文库来源的新的酯酶基因的克隆、表达及酶学性质[J]. 微生物学报 2010(07)
    • [3].细菌人工染色体基因组文库构建关键技术研究[J]. 生物技术通报 2008(04)
    • [4].书讯[J]. 农药学学报 2012(03)
    • [5].血清Ⅱ型鸭疫里默氏杆菌基因组文库的构建[J]. 中国动物传染病学报 2010(06)
    • [6].CRISPR/Cas9-sgRNA全基因组文库筛选人单核细胞白血病功能性促癌/抑癌基因体系的建立与优化[J]. 中国科学:生命科学 2016(07)
    • [7].中华绒螯蟹部分基因组文库构建和微卫星位点的筛选[J]. 上海海洋大学学报 2009(02)
    • [8].《元基因组学:方法和步骤》(影印版)[J]. 北方园艺 2012(10)
    • [9].《元基因组学:方法和步骤》(影印版)[J]. 遗传 2012(06)
    • [10].人工染色体载体的研究和应用[J]. 中国现代医药杂志 2008(10)
    • [11].猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白基因的克隆与表达[J]. 黑龙江畜牧兽医 2009(15)
    • [12].长爪沙鼠不同willis血管类型全基因组文库构建[J]. 中国比较医学杂志 2014(11)
    • [13].鼠疫菌EV76株BAC基因组文库的构建[J]. 中国地方病防治杂志 2019(01)
    • [14].叶围微生物宏基因组文库的构建和分析[J]. 广西农业科学 2008(03)
    • [15].宏基因组文库中的组成型启动子在大肠杆菌中的克隆[J]. 基因组学与应用生物学 2010(06)
    • [16].欧文氏杆菌CXJZ11-01基因组文库的构建[J]. 湖北农业科学 2008(06)
    • [17].一种新型β-葡萄糖苷酶基因的分析[J]. 中国酿造 2009(05)
    • [18].1株中度嗜盐菌质粒基因组文库的构建及2个膜蛋白基因的克隆和序列分析[J]. 微生物学杂志 2012(06)
    • [19].巴西橡胶树简单重复序列的鉴定及分离[J]. 世界热带农业信息 2011(03)
    • [20].利用CRISPR/Cas9全基因组文库筛选HCT 116细胞增殖相关基因[J]. 军事医学 2018(11)
    • [21].猪胸膜肺炎放线杆菌自动转运黏附素基因的克隆与表达[J]. 黑龙江畜牧兽医 2010(01)
    • [22].绿木霉ZBS6黏粒基因组文库的构建及质量鉴定[J]. 河南农业科学 2012(12)
    • [23].猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白结构与功能的研究[J]. 天津农学院学报 2010(02)
    • [24].宏基因组与宏基因组学[J]. 中国生物化学与分子生物学报 2010(02)
    • [25].双孢蘑菇不同交配型同核不育单孢的基因组文库构建[J]. 福建农业学报 2017(12)
    • [26].奶牛瘤胃微生物元基因组文库中脂肪酶的筛选与酶学性质[J]. 生物工程学报 2009(06)
    • [27].马链球菌抗吞噬蛋白的鉴定[J]. 黑龙江畜牧兽医 2010(17)
    • [28].玉米籽粒长度的全基因组关联分析[J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版) 2018(06)
    • [29].宏基因组文库新型β-葡萄糖苷酶的筛选、克隆及酶学性质分析[J]. 食品科学 2018(04)
    • [30].Survivin及其抑制剂的研究进展[J]. 食管外科电子杂志 2014(01)

    标签:;  ;  ;  ;  ;  ;  

    放线菌有序基因组文库的构建和应用及遗传因子的研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢