RNA干扰HIF-1α对食管鳞癌细胞Eca-109糖酵解相关基因表达的影响

论文摘要

背景:食管鳞癌是我国常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居世界前列。肿瘤细胞依赖糖酵解获得能量的特点是其缺氧耐受的代谢基础,也是对放化疗抵抗的重要原因。缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1,HIF-1）是广泛存在于哺乳动物体内的一种转录因子,是机体适应缺氧微环境的关键调节因子,在食管鳞癌中高表达,并与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处器官转移以及肿瘤的TNM分期密切相关。HIF-1α可能是调节肿瘤细胞糖酵解的重要蛋白,已经成为肿瘤发病机制和治疗研究方面的热点之一。目的:观察在人食管鳞癌细胞Eca-109中RNA干扰抑制HIF-1α的效果及常氧及缺氧培养下RNA干扰HIF-1α基因对糖酵解相关基因表达的影响,探讨HIF-1α基因与食管癌细胞糖酵解通路之间的关系。方法:1.食管鳞癌细胞Eca109予以常氧和缺氧培养,缺氧培养时间分别为6、12、24、48小时,采用Western印迹检测细胞中HIF-1α蛋白的表达变化,选择可以引起HIF-1α蛋白表达最高的时间点作为缺氧培养时间。2.选择3组细胞分别为食管鳞癌Eca-109细胞,稳定转染HIF-1αShRNA及空质粒的Eca-109细胞,分别常氧培养及缺氧培养,Western blot检测HIF-1α表达,鉴定稳转HIF-1αShRNA的Eca-109细胞株的干扰效果。3.三组细胞分别予以常氧和缺氧培养,半定量RT-PCR检测Glut-1、LDH-A、HK-II糖酵解相关基因mRNA的表达。4.三组细胞分别予以常氧和缺氧培养,Western blot检测Glut-1、LDH-A、HK-II糖酵解相关基因蛋白的表达。5.三组细胞分别予以常氧和缺氧培养,分光光度法测定胞液中乳酸脱氢酶、已糖激酶酶活性。6.三组细胞分别予以常氧和缺氧培养,分光光度法测定培养上清液中乳酸浓度。结果:1.常氧状态下,在Eca109细胞中存在HIF-1α蛋白的表达,物理缺氧培养12小时HIF-1α表达最强,选取12小时为后续实验的缺氧时间。2.干扰细胞常氧下HIF-1α几乎无表达,缺氧后亦无增强现象。3.干扰细胞Glut-1、LDH-A、HK-IImRNA表达较未干扰细胞明显减弱（P<0.05）,未干扰细胞缺氧后表达稍增强,差异有统计学意义（P<0.05）。4.干扰细胞Glut-1、LDH-A、HK-II蛋白表达较未干扰细胞明显减弱（P<0.05）,未干扰细胞缺氧后表达稍增强,差异有统计学意义（P<0.05）。5.干扰细胞胞液乳酸脱氢酶、已糖激酶酶活性较未干扰细胞减弱明显（P<0.05）,未干扰细胞缺氧后表达稍增强,但差异无统计学意义（P>0.05）。6.干扰细胞上清液乳酸浓度较未干扰细胞减弱明显（P<0.05）,未干扰细胞缺氧后表达稍增强,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1、HIF-1α蛋白表达与食管癌细胞缺氧时间密切相关,缺氧12小时HIF-1α蛋白表达高峰。2、本实验RNA干扰细胞常氧下HIF-1α蛋白几乎无表达,缺氧后亦无增强现象,表明我们利用RNA干扰技术成功抑制了食管鳞癌细胞Eca-109的HIF-1α表达。3、本研究中,食管癌细胞利用RNA干扰HIF-1α表达沉默后,Glut-1、LDH-A、HK-II的表达也明显下调,表明Glut-1、LDH-A、HK-II均是HIF-1的靶基因。4、本研究食管癌细胞HIF-1α表达被抑制后,糖酵解相关基因的表达及乳酸水平明显受抑制,表明无论在常氧还是缺氧条件下,HIF-1α基因与食管癌细胞糖酵解通路密切相关。

论文目录

• 一、英文缩略词表
• 二、中文摘要
• 三、英文摘要
• 四、论文正文
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 五、参考文献
• 六、综述与参考文献
• 七、文章发表情况
• 八、致谢