论文摘要
凋亡诱导因子AIF是一类进化上高度保守的黄素蛋白。正常情况下,AIF定位在细胞的线粒体内膜,能催化电子在细胞色素C与NAD之间的传递,发挥氧化还原酶的功能；当细胞受到凋亡信号的刺激时,AIF被钙蛋白酶从线粒体内膜切下,释放进入胞质,通过其N端的核定位序列转位进入细胞核,在细胞核中,AIF可直接与DNA结合,与亲环蛋白A （CypA）及H2AX共同作用引起染色质凝集和DNA的大片段化,从而导致细胞凋亡。AIF引起的细胞凋亡是caspase非依赖的,用caspase的广谱抑制剂Z-VAD fmk等均不能抑制AIF引起的细胞凋亡。目前针对AIF从线粒体释放入胞质并转位进入细胞核的机制有较清楚的研究,但是对AIF进入细胞核后如何介导染色质凝集及DNA降解的机制研究的还不够透彻。我们通过质谱数据发现了AIF的一种新的结合蛋白一一SirT1。SirT1是一种NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶类,能够与多条信号转导通路中的蛋白相互作用,通过对生物体内的赖氨酸残基、组蛋白、转录因子等进行去乙酰化,参与细胞周期调控、细胞衰老凋亡、神经保护、胰岛素分泌、糖脂类代谢、炎症氧化应激反应、血管生成等过程,行使其对基因的调控功能。为了进一步研究AIF与SirT1的相互作用,我们进行了细胞内与体外实验两方面的探索。在本课题中,我们通过原核表达系统纯化的GST标签蛋白与His标签蛋白,证明AIF与SirT1能够在体外直接结合。并且,我们在体内实验中证明了AIF存在乙酰化修饰且SirT1能够对其进行去乙酰化,并发现AIF的K295位是其主要的乙酰化位点。此外,通过凝胶阻滞实验,我们发现SirT1对AIF功能的影响并不是通过去乙酰化AIF来影响AIF与DNA的结合能力,而是通过影响AIF与CypA的结合,从而抑制AIF行使诱导凋亡的功能。本论文的实验结果主要通过体外的生化及功能性实验为体内研究AIF与SirT1的相互作用补充,同时,为AIF的翻译后修饰研究揭开序幕,对深入研究AIF入核后行使凋亡的机制提供了依据。