地衣芽胞杆菌补料发酵及硝酸盐还原生理功能的研究

论文摘要

聚γ-谷氨酸（γ-PGA）作为一种微生物合成的水溶性可生物降解的氨基酸高分子聚合物,可以广泛地应用于医药、食品、轻化工、环保和农业等领域。高水平的发酵技术是提高y-PGA生产效率、降低其成本及扩大γ-PGA应用的关键环节。这个环节目前主要面临两个问题：其一,γ-PGA发酵水平不高；第二是发酵过程中高粘度体系所引起的溶氧水平下降。本文研究了地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）WX-02分批补料γ-PGA发酵技术及氧电子受体的潜在替代物——硝酸盐对其发酵的影响。考察初始葡萄糖浓度对γ-PGA发酵的影响,得到最适的葡萄糖浓度为70 g/L进一步优化得到摇瓶中葡萄糖补加方案,即初始葡萄糖浓度为70 g/L,发酵至15h补加15 g/L葡萄糖,将其在3L发酵罐进行验证,结果如下：生物量和γ-PGA产量分别为3.9 g/L和44.5 g/L,与对照相比分别提高了56%和50%；谷氨酸利用率达45.7%,而对照中仅为30.0%。同时,培养基中最适硝酸钠浓度为10 g/L,生物量和γ-PGA产量可分别达到3.3g/L和31.0 g/L；优化的摇瓶中硝酸钠补加方案为：初始硝酸钠浓度为10 g/L,发酵至12h补加5g/L硝酸钠,将其在3L发酵罐验证,生物量达到4.5 g/L,与对照相比提高50%；γ-PGA产量最大值为38.7 g/L,与对照相比提高了15%。进一步考察了6种氨基酸和6种有机酸及甘油对γ-PGA发酵的影响,发现它们都能提高γ-PGA产量,其中20 g/L甘油、5g/L乳酸和2.5 g/L琥珀酸的效果最好,γ-PGA产量分别提高了49%、38%和35.5%。另外,研究了硝酸盐还原对B. licheniformis WX-02发酵生产γ-PGA生理功能的影响,发现在加有硝酸钠的培养基中,其生物量在稳定期与对照相比OD600提高了1.9,粘度提高了3倍,谷氨酸的利用率由47.1%提高到76.5%,γ-PGA最终产量提高了130%。硝酸钠的加入使糖酵解和TCA循环关键代谢产物丙酮酸含量明显增加；同时,代谢副产物甲酸、乙酸和乳酸在发酵终点的浓度也分别比对照提高了2.20倍、1.12倍和0.23倍。测定发酵过程中pH的变化则表明,加有硝酸钠的培养基中有机酸大量产生,但并未使培养基的pH大范围降低。发酵后期,加硝酸钠处理组中pH反而略高于对照,说明硝酸盐还原对发酵体系具有一定的调节作用。酶活性测定结果则表明,B. licheniformis WX-02在发酵过程中自然表达了硝酸还原酶,且硝酸盐的加入增强了硝酸还原酶活性,强化了硝酸盐的还原作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 γ-PGA的性质和应用
• 1.1.1 γ-PGA的性质
• 1.1.2 γ-PGA的应用
• 1.2 γ-PGA的合成
• 1.2.1 化学合成法
• 1.2.2 提取法
• 1.2.3 酶转化法
• 1.2.4 微生物发酵法
• 1.3 γ-PGA微生物发酵研究现状
• 1.3.1 碳源
• 1.3.2 氮源
• 1.3.3 谷氨酸
• 1.3.4 金属离子
• 1.3.5 pH
• 1.3.6 溶氧
• 1.4 补料发酵研究
• 1.4.1 微生物的培养方式
• 1.4.2 补料培养的优点和缺点
• 1.4.3 补料分批发酵的应用
• 1.5 硝酸盐还原的功能与应用
• 1.6 本研究的目的与意义
• 第二章 γ-PGA分批补料发酵的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 培养条件
• 2.2.5 发酵液粘度的检测
• 2.2.6 生物量的检测
• 2.2.7 γ-PGA产量的测定
• 2.2.8 γ-PGA分子量的检测
• 2.2.9 葡萄糖和谷氨酸的测定
• 2.2.10 葡萄糖浓度对γ-PGA发酵的影响
• 2.2.11 葡萄糖补料发酵研究
• 2.2.12 硝酸钠浓度对γ-PGA发酵的影响
• 2.2.13 硝酸钠补料发酵研究
• 2.2.14 硝酸钠浓度对γ-PGA分子量的影响
• 2.2.15 代谢中间物对γ-PGA发酵的影响
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 γ-PGA补糖发酵工艺研究
• 2.3.2 γ-PGA补加硝酸钠发酵工艺研究
• 2.3.3 硝酸钠浓度对γ-PGA分子量的影响
• 2.3.4 代谢中间物对γ-PGA发酵的影响
• 2.4 小结
• 第三章 硝酸盐还原生理功能研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 培养条件
• 3.2.6 发酵液粘度的检测
• 3.2.7 生物量的检测
• 3.2.8 γ-PGA产量的测定
• 3.2.9 葡萄糖和谷氨酸的测定
• 3.2.10 硝酸盐还原酶（NR）测定
• 3.2.11 硝酸钠浓度的测定
• 3.2.12 亚硝酸钠浓度的测定
• 3.2.13 有机酸测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 硝酸盐对地衣芽胞杆菌厌氧生长的影响
• 3.3.2 硝酸盐还原对γ-PGA发酵的影响
• 3.3.3 硝酸盐还原对γ-PGA发酵过程中有机酸含量的影响
• 3.3.4 硝酸钠对γ-PGA发酵过程中硝酸还原酶的影响
• 3.4 小结
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表论文