一种基于生物素与亲和素的快速筛选阳性细胞系统的构建

论文摘要

建立用于功能研究和用于基因治疗的稳定细胞系,非常关键的一点是需要选择有效的方法筛选出基因修饰的阳性细胞。目前应用比较广的筛选阳性细胞的传统方法主要包括:利用流式细胞仪分选带有荧光标记的基因修饰的阳性细胞和利用其它报告基因,如半乳糖苷酶和抗生素抗性基因,来筛选基因修饰的阳性细胞等。但是,当前这些可用的阳性细胞筛选方法有很多缺陷。尽管荧光分选阳性细胞的方法是非常有效,但是要求价格昂贵的流式细胞仪,然而一般的实验室支付不起。利用半乳糖苷酶筛选细胞一般用于筛选单个阳性克隆细胞,但是在这些细胞中检测目的基因的操作非常费时费力。用抗生素筛选到目的细胞经常是不含有目的基因的假阳性细胞,而且这些细胞由于含有抗生素抗性基因而不适于临床应用。因此,急需建立一种快速、高效、操作简便的筛选基因修饰的阳性细胞的方法。本研究的目的是要构建一种不仅可以满足上述要求而且同时可以筛选两个目的基因的新型阳性细胞筛选系统,希望此系统可以生物学研究和临床治疗上具有广泛的应用。所构建的阳性筛选系统基于生物素与亲和素/链亲和素之间的特异的高亲和力（Ka=1014～1015M-1）。它含有两个报告元件:BirA酶和一个融合蛋白A2TM。BirA酶催化生物素特异地共价连接到BirAtag（GLNDIFEAQKIEWHE）中的Lysε-NH2上;A2TM是由人的HLA-A2的胞外部分融合BirAtag的融合蛋白,它可以将BirAtag表达到细胞表面。只要这两个元件和目的基因被递送到细胞之中,连接有生物素的BirAtag就会表达到基因修饰的细胞表面,耦联有链亲和素的固相（如磁珠）可以很容易捕获这种细胞并高效地将基因修饰的细胞筛选出来。四质粒的慢病毒基因递送系统具有比较宽的细胞宿主范围、高效的递送基因递送效率以及使目的基因长效表达的优点,为筛选系统的可行性和筛选效率提供了保障。为使报告元件正确表达,在A2TM和BirA酶的N端都连接了内质网（ER）信号肽,使其表达后直接进入ER;同时为了增加BirAtag在ER中的生物素化效率,在BirA酶的C端连接ER滞留序列（SEKDEL）。修饰后的A2TM和BirA酶基因分别插入到两个慢病毒载体中。载体上的另外两个表达盒用于表达目的基因。当病毒载体转染或感染细胞之后,细胞中除了表达一个（或多个）目的蛋白外,BirA酶表达后被滞留在ER中,融合BirAtag的跨膜蛋白A2TM在表达后通过ER时被BirA酶高效地生物素化。跨膜蛋白A2TM将生物素化了的BirAtag携带到细胞表面。包被有亲和素或链亲和素的顺磁磁珠可以非常迅速地捕获细胞表面带有生物素化的BirAtag的阳性细胞。利用一个磁力架将细胞吸到管壁,去掉悬浮的细胞后。分离之后,磁珠可以从细胞分离下来。与此同时,为了筛选更加方便,还构建了只包含一个表达盒表达A2TM或BirA的相关载体。在本研究中,所构建的阳性细胞筛选系统初步应用于3个方面:1、用此筛选系统筛选单个基因修饰的阳性细胞。被克隆GFP报告基因的带有BirAtag的载体与另一个表达BirA酶的载体共转染细胞。利用链亲和素包被的磁珠可以将表达GFP的阳性细胞吸附出来。同样,T细胞抗原肽flu/gp100通过linker与人的微球蛋白（β2m）连接后可以在β2m为阴性人结肠癌细胞系HCT和转入人的HLA-A2重链的B16AAD细胞系中表达。筛选到的细胞可以表达带有flu/gp100抗原肽的MHC-I复合体。这些细胞可以作为针对pMHC-I-flu/gp100复合体的CTLs间接杀伤试验的靶细胞。2、用此筛选系统筛选两个基因修饰的阳性细胞。这两个目的基因为ICP47和β2m-flu/gp100。在第一个应用中,β2m-flu/gp100已经被插入到筛选系统的一个载体中,将ICP47蛋白基因导入筛选系统的另外一个载体,此筛选系统用于筛选特异表达β2m-flu/gp100和ICP47的抗原提呈细胞,如CD40B和DC。这些细胞可以用于将抗原肽flu/gp100高效提呈给T细胞的研究。3、此筛选系统可以用于递送针对HLA-A2黑色素瘤细胞MART1或gp100抗原肽的TCR样单域抗体（VHH）进入NK92mi细胞系。人自然杀伤细胞（NK）细胞系NK92mi在体内外都具有很强杀伤肿瘤的能力。在此应用中,为使NK92mi细胞具有CTL的特异性杀伤肿瘤的功能,将这些VHH融合到A2TM的N端使其表达到细胞的表面。在含有BirA基因的载体中插入了GFP基因。用此系统筛选既具有绿色荧光的又在细胞表面表达TCR样单域抗体的特异性NKmi细胞。所筛选出的细胞可以用于NK细胞的特异杀伤肿瘤的研究。总之,我们构建成了一种快速、操作简便、可行的筛选目的基因修饰的阳性细胞的系统,从筛选一个或同时筛选两个基因修饰的阳性细胞的应用角度对此筛选系统进行了探讨。为了在研究和临床治疗上能得到广泛应用,该筛选系统的优化和在不同的基因递送系统上的广泛应用方面都还需要进一步调查研究。

论文目录

• 缩略词
• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 第一部分 生物素、亲和素及二者相互作用
• 第二部分 反转录病毒和慢病毒载体
• 第三部分 论文研究内容
• 第二章 基于生物素与亲和素的阳性细胞筛选系统的构建
• 第一部分 筛选系统载体的构建
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 第二部分 筛选系统的功能试验
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果与讨论
• 小结
• 第三章 筛选系统相关载体的构建
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 小结
• 第四章：阳性细胞筛选系统的应用
• 第一部分 应用一
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 第二部分 应用二
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 第三部分 应用三
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 作者简历
• 致谢