抗血小板人源噬菌体抗体库的构建和初步筛选

论文摘要

噬菌体抗体库是把体外随机组合的全套抗体基因呈现在丝状噬菌体表面,通过抗原的亲和力选择和噬菌体扩增获得特异性抗体基因的技术。该技术已广泛用于制备人源单克隆抗体及免疫学研究中。本研究旨在运用噬菌体抗体库技术构建一个经血小板自身免疫的抗体组合文库,为下步筛选针对血小板特异性靶点如GPⅡb/Ⅲa等的人源抗体,进行以GPⅡb/Ⅲa受体等作为靶点的治疗性人源抗体的研究和开发奠定基础。 实验首先从三名慢性特发性血小板减少性紫癜患者的外周血中分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,通过半巢式PCR扩增抗体轻链κ链基因和重链Fd段基因。先将轻链基因克隆到pComb3中,电转化TG1菌构建成κ轻链文库,经30次电转后将轻链库混合,库容量达到2.88×106cfu,轻链插入率为60%。随后将重链Fd段基因克隆到κ轻链文库中,经20次电转后将抗体库混合,得到库容约为2.3×106cfu的人源噬菌体Fab抗体库,同时含有轻链κ链基因和重链Fd基因的噬菌体约占40%。经辅助噬菌体超感染的噬菌体抗体库滴度为5×1012pfu/Ml. 用人活化的血小板包被96孔板,对抗体库进行3轮“吸附—洗脱—扩增”的亲和选择,特异性噬菌体抗体得到有效的富集。经ELISA鉴定,获得几株ELISA活性较高的能与人血小板结合的克隆。测序结果经分析后显示抗体轻链和重链Fd段在核苷酸和氨基酸水平都符合人免疫球蛋白基因结构特征。 以上结果表明本研究利用慢性特发性血小板减少性紫癜病人来源的抗体基因所构建的人源性抗血小板噬菌体抗体库是成功的,可用于进一步筛选针对血小板特异性靶点如GPⅡb/Ⅲa等的人源抗体,进行以GPⅡb/Ⅲa受体等作为靶点的治疗性人源抗体的研究和开发。

论文目录

• 英文缩略词表
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• 前言
• 第一部分 ITP患者外周血B淋巴细胞扩增抗体基因
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果
• 4.讨论
• 第二部分 抗血小板人源噬菌体抗体库的构建
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果
• 4.讨论
• 第三部分 抗血小板抗体的初步筛选
• 1.实验材料
• 2.实验方法
• 3.实验结果
• 4.讨论
• 总结
• 参考文献：
• 致谢
• 综述