不同种类除草剂的作用方式研究及ACCase CT功能域模型的建立

论文摘要

许多作用于植物脂代谢的除草剂已经广泛应用了很多年,HRAC根据其作用位点,耐受性形式,诱导症状或者化学结构对多种除草剂进行分类,通过[1-14C]Acetate或者[2-14C]Malonate作为底物合成带有同位素标记的脂肪酸的试验对这些化合物的作用方式进行研究,发现其中一些除草剂对植物脂肪酸并没有影响,因此对除草剂抗性作用委员会对除草剂的分类提出了异议。其中很多种除草剂的直接作用位点是ACCase CT功能域,ACCase在大多数生物的脂肪酸代谢中起关键作用。它是一类生物素依赖酶,催化脂肪酸从头合成的第一步,对大多数生物体来说是必需的。并且酿酒酵母ACCase CT功能域与禾本科植物来源ACCase CT功能域的同源性达到50%以上,因此通过获取真核生物酿酒酵母ACCase CT功能域基因,并在大肠杆菌中以包涵体形式表达,成功的溶解复性包涵体,最终得到有生物活性的蛋白,成功地为以后研究植物体以及其他来源的ACCase CT功能域建立了模型,为新型除草剂以及作用机理的研究提供了有利的依据。

论文目录

• 提要
• 第一章 绪论
• 1.1 植物脂肪酸
• 1.2 脂肪酸的生物合成
• 1.2.1 脂肪酸从头合成
• 1.2.1.1 脂肪酸生物合成acyl-coA 的来源
• 1.2.1.2 脂肪酸合成酶（FAS）
• 1.2.2 脂肪酸的修饰
• 1.3 生物素和生物素酶
• 1.4 乙酰辅酶A 羧化酶
• 1.4.1 ACCase 的类型
• 1.4.1.1 异质型ACCase
• 1.4.1.2 同质型ACCase
• 1.4.1.3 植物中的ACCase
• 1.4.2 ACCase 的结构
• 1.4.2.1 生物素羧化酶（BC）的结构
• 1.4.2.2 羧基转移酶（CT）的结构
• 1.4.2.3 生物素载体蛋白（BCCP）的结构
• 1.4.3 ACCase 的生物学功能
• 1.4.3.1 ACCase 是脂肪酸合成的关键限速酶
• 1.4.3.2 植物细胞中ACCase 的功能
• 1.4.3.3 动物细胞中ACCase 的功能
• 1.5 化学除草剂在农业中的应用
• 1.5.1 化学除草剂的除草机理
• 1.5.2 化学除草剂应用中存在的主要问题
• 1.6 本研究意义及实验设计
• 1.6.1 研究意义
• 1.6.2 实验设计
• 1.7 参考文献
• 第二章 除草剂对大麦和黄瓜叶片脂肪酸的影响
• 2.1 前言
• 2.2 实验设计
• 2.3 实验材料
• 2.3.1 主要仪器
• 2.3.2 主要试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 大麦（Maris otter）和黄瓜（Restina） 的栽培
• 2.4.2 除草剂水溶液的配制
• 2.4.3 大麦叶片同位素标记实验
• 2.4.4 黄瓜叶片同位素标记试验
• 2.4.5 大麦，黄瓜叶片总脂类的提取与检测
• 2.4.6 大麦，黄瓜叶片脂肪酸甲酯的提取与检测
• 2.5 结果与讨论
• 2.5.1 同位素标记实验条件的优化
• 2.5.1.1 不同有机溶剂对脂肪酸合成的影响
• 2.5.1.2 不同有机溶剂,不同的孵育方法对脂肪酸合成的影响
• 2.5.2 “K3”和“Z”类型除草剂对植物脂肪酸合成的影响
• 14C] Acetate 标记实验'>2.5.2.1 [1-¹⁴C] Acetate 标记实验
• 14C] Malonate 标记实验'>2.5.2.2 [2-¹⁴C] Malonate 标记实验
• 2.5.3 Pinoxaden 对植物脂类的影响
• 14C] Acetate 标记实验'>2.5.3.1 [1-¹⁴C] Acetate 标记实验
• 2.6 本章小结
• 2.7 参考文献
• 第三章 酿酒酵母ACCASE CT 功能域基因克隆、表达以及性质研究
• 3.1 CT 功能域基因克隆
• 3.1.1 引言
• 3.1.2 实验设计
• 3.1.3 实验材料
• 3.1.3.1 主要仪器
• 3.1.3.2 主要试剂
• 3.1.3.3 实验菌株
• 3.1.3.4 实验用质粒
• 3.1.3.5 溶液配制
• 3.1.4 实验方法
• 3.1.4.1 酵母总RNA 提取
• 3.1.4.1.1 酵母的培养
• 3.1.4.1.2 酵母菌株总RNA 提取
• 3.1.4.1.3 酵母总RNA 鉴定
• 3.1.4.2 酵母cDNA 文库的制备—逆转录反应
• 3.1.4.3 目的基因的扩增
• 3.1.4.4 重组质粒的构建
• 3.1.4.5 BH28a 重组质粒转化大肠杆菌
• 3.1.4.6 目的基因的诱导表达
• 3.1.4.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.1.4.8 表达条件的优化
• 3.1.4.8.1 表达菌株的优化
• 3.1.4.8.2 最佳表达温度确定
• 3.1.4.8.3 IPTG 诱导条件的优化
• 3.1.5 结果与讨论
• 3.1.5.1 酵母总RNA 的提取
• 3.1.5.2 PCR 扩增目的基因
• 3.1.5.2.1 酵母ACCase CT 功能域基因的确定
• 3.1.5.2.2 特异性引物扩增目的基因
• 3.1.5.3 酵母ACCase CT 功能域基因重组质粒的构建
• 3.1.5.4 表达载体
• 3.1.5.5 重组质粒表达条件的优化
• 3.1.5.5.1 表达菌株的选择
• 3.1.6 小结
• 3.2 包涵体的溶解与复性
• 3.2.1 前言
• 3.2.2 实验材料
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 细胞破碎及蛋白提取
• 3.2.3.2 包涵体的洗涤与溶解
• 3.2.3.3 NI-亲合层析纯化
• 3.2.3.3.1 Ni-亲合层析柱处理
• 3.2.3.3.2 Ni-亲合层析纯化
• 3.2.3.4 蛋白浓度的测定
• 3.2.3.5 包涵体的复性
• 3.2.3.5.1 稀释复性法
• 3.2.3.5.2 透析复性法
• 3.2.3.5.3 系统透析复性法
• 3.2.3.5.4 活力测定
• 3.2.3.5.5 复性蛋白的荧光光谱分析
• 3.2.3.5.6 复性蛋白的圆二色谱分析
• 3.2.4 结果与讨论
• 3.2.4.1 包涵体的洗涤与溶解
• 3.2.4.2 亲合层析纯化
• 3.2.4.3 包涵体的复性
• 3.2.4.4 不同复性方法酶活力的比较
• 3.2.4.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.4.6 荧光光谱测定
• 3.2.4.7 圆二色谱分析
• 3.2.5 小结
• 3.3 参考文献
• 全文总结
• 1. 已取得成果
• 2. 研究中存在的问题
• 3. 展望
• 3.1 对Acetamides 的进一步研究
• 3.2 ACCase CT 功能域模型的进一步优化
• 博士论文期间主要成果
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT