LINE-1甲基化与肝癌临床病理和预后关系

论文摘要

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC以下简称肝癌）是全球最常见的恶性肿瘤之一,其发生发展是多阶段（从炎症感染、组织纤维化、慢性肝硬化至肝癌）、多致瘤因素累积的过程,尽管近年来对肝癌发生发展的病理研究已取得很大进展,但对其分子机制的理解仍然有限。DNA甲基化通过结合甲基化结合域（MBD）和组蛋白乙酰化能引起基因的表达沉默,而去甲基化则能激活基因的表达。在肿瘤形成中,DNA甲基化紊乱可表现为基因组整体的低甲基化（hypomethylation）以及特定区域（如启动子区域）高甲基化（hypermethylation）。人类肿瘤基因组的整体低甲基化现象早在1983年被Feiberg等发现。低甲基化与基因组稳定性密切相关,影响基因正常表达,导致细胞的增殖失控,促进肿瘤的发生发展。肿瘤细胞中基因组整体甲基化水平降低的表观遗传学改变已经成为肿瘤分子病理研究的热点。人类染色体中心体周围的异染色质紧密封装着大量DNA重复序列（LINE, SINE,IAP,和Alu片段）。为了减少转录“噪音”,提高转录效率,在正常细胞中,异染色质处于高度甲基化的表观遗传学上的沉默状态。而在肿瘤中,基因组的低甲基化往往伴随着DNA重复序列的低甲基化。其中LINE-1序列的低甲基化现象已在多种肿瘤中被证实,包括结肠癌,膀胱上皮癌,恶性生殖细胞瘤,卵巢癌,宫颈癌,前列腺癌等。目前,LINE-1甲基化状态已经成为肿瘤基因组整体低甲基化水平的标记物。目前关于在肝癌中研究LINE-1的甲基化修饰的报道很少,在组织标本中的研究仅提示9例肝癌组织与癌旁组织中存在LINE-1甲基化频率的差异,研究标本的数量非常有限,与临床病理的关系也没有得到探讨。另有在病人血清中LINE-1的甲基化研究提示肝癌病人血清中LINE-1甲基化水平低于肝硬化、肝炎病人血清中LINE-1甲基化水平,血清LINE-1甲基化水平与病人预后生存率相关。但是因为血清中肿瘤细胞量少,不能完全体现肿瘤组织中LINE-1基因甲基化修饰情况。对肝癌组织标本的检测,更能全面地反映患者LINE-1基因甲基化水平,从而观察此基因甲基化修饰在肝癌发生发展过程中的作用。本研究拟采用实时定量甲基化特异性聚合酶链反应（real-time quantitative methylation-specific PCR）技术,检测95例HCC癌组织和相应癌旁组织及10例正常肝组织中LINE-1序列的甲基化状态,探讨肝癌基因组整体甲基化状态并分析其与临床病理的关系,以期进一步阐述肝细胞癌的表观遗传分子机制。本实验主要有以下二部分组成：一、RTQ-MSP检测LINE-1序列甲基化的方法建立和检测本实验采用实时定量MS-PCR,即在重亚硫酸盐处理的基础上用实时定量荧光PCR仪对甲基化扩增产物（M）和非甲基化扩增产物（U）进行定量检测,然后根据公式：甲基化水平=M/M+U×100%计算LINE-1的甲基化水平,可对LINE-1的甲基化水平进行量化。我们对95例肝癌、癌旁组织及10例正常组织中LINE-1序列的甲基化水平进行了检测。结果显示,肝癌组织中LINE-1甲基化水平为75.91%（mean）,癌旁组织中LINE-1甲基化水平为92.48%（mean）,正常肝组织中line-1甲基化水平为95.30%（mean）,肝癌组织LINE-1的甲基化水平明显低于癌旁（p<0.001）和正常肝组织（p<0.001）,结论：和其他肿瘤一样,在肝癌中也存在着LINE-1低甲基化现象。本部分实验结果提示LINE-1低甲基化可能在肝癌发生发展的过程中有非常重要的作用。二、LINE-1甲基化水平与肝癌临床病理和预后的关系我们收集了95例病人的临床病理资料,对病人进行随访,掌握病人预后情况,对临床病理资料与LINE-1甲基化水平进行统计分析；使用K-M生存曲线分析LINE-1甲基化水平高组与LINE-1甲基化水平低组肝癌患者生存期上的差别。根据肝癌组织中的LINE-1平均甲基化水平（75.91%）,我们将肝癌病例分为LINE-1甲基化水平<75.91%组和LINE-1甲基化水平>75.91%组与临床病理资料进行分析,结果发现LINE-1甲基化水平与肿瘤有无包膜、有无血管侵犯、肿瘤大小、血清HBV DNA定量、肝癌TNM分期相关。仅一步分析结果显示,肿瘤直径越大、血清HBV DNA定量值越高、TNM分期越靠后的病例其LINE-1甲基化水平越低。肿瘤直径≥7cm的肝癌中LINE-1甲基化水平（65.11%）明显低于肿瘤直径（4<d≤7cm）组（77.62%）（p=0.044）和肿瘤直径（≤4cm）组（89.19%）（p<0.001）。同时,血清HBV DNA定量高组（≥1×105copy/ml）的肝癌病例中的LINE-1甲基化水平（62.38%）明显低于血清HBV DNA定量中（1×103-1×105 copy/ml）组（76.55%）（p=0.048）和血清HBV DNA定量低（<1×103copy/ml）组（86.98%）（p<0.001）。TNMI-Ⅱ期组病例的LINE-1甲基化水平86.87%明显高于TNMⅢ期组63.96%（p<0.001）和TNMⅣ期组37.39%（p<0.001）。在LINE-1甲基化水平高组（≥75.91%）和LINE-1甲基化水平低组（<75.91%）患者有不同的术后生存率,两者具有统计学差异（p=0.022）。结论：1、LINE-1甲基化水平与肝癌肿瘤大小、血清HBV DNA定量、TNM分期和病人生存率相关；2、LINE-1甲基化定量检测可以作为肝癌预后的分子标记物。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 主要仪器设备
• 主要实验试剂
• 前言
• 第一部分 RTQ-MSP检测LINE-1甲基化的方法建立
• 技术路线
• 研究对象
• 实验试剂
• 实验方法及步骤
• 结果
• 讨论
• 第二部分 LINE-1甲基化与肝癌临床病理和预后关系
• 一、实验方法
• 二、研究结果
• 讨论
• 参考文献
• 文献综述一
• 参考文献
• 文献综述二
• 参考文献
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明
• 致谢