还原型谷胱甘肽高产菌的胁迫生理特性与高密度发酵过程优化技术

论文摘要

还原型谷胱甘肽（y-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH）是一种非蛋白巯基化合物,广泛分布在各种生物活细胞内。GSH在细胞内参与了许多生理活动并起到非常重要的作用,最主要三种功能：（1）作为抗氧化剂,维持细胞内氧化还原状态；（2）在高等真核细胞中作为免疫增加剂；（3）作为解毒剂。这些特点使GSH广泛应用在疾病治疗上,比如肝硬化、糖尿病、神经退行性疾病和抗衰老等,因此GSH认为是生物体内最重要的一种能自我生产的抗疾病防卫小分子化合物。目前GSH作为一种药物广泛使用在医疗行业,如果产品价格能进一步降低,它在食品和化妆品行业也有很好的应用前景,因此GSH的市场需求在进一步扩大。但是,我国发酵法生产GSH仍停留在工业化试验阶段,尚未有企业成功实现发酵法生产GSH。为此,本论文针对国内目前GSH发酵生产过程中发酵水平和分离纯化技术所遇到的难题,基于多尺度参数相关分析,对GSH高产菌开展菌种生理特性和发酵过程优化研究,具体研究结果如下：1.GSH高产菌菌种鉴定和基本胁迫生理特性研究以GSH高产菌株的总DNA为模板,采用真菌通用引物,对其26S rDNA D1/D1区进行特异扩增,产物回收后测序,测序结果与NCBI的DNA数据库中已知菌种的26S rDNA序列进行比对,发现GSH高产菌株是一株酿酒酵母菌,命名为酿酒酵母T65。对此高产菌株和酿酒酵母W303A进行高浓度乙醇、葡萄糖、高温、高渗透压、营养饥饿、低pH、氧化胁迫和抗生素G418和Zecin毒性的耐受性分析,发现此高产菌株对测定的胁迫条件均表现出相对较好的耐受性。另外它能在酵母SD-URA培养基中生长,说明此高产菌株不是尿嘧啶缺陷型。GSH高产菌的这些生理数据为下一步研究高密度发酵生产GSH提供生理生化基础指导。2.基于在线活细胞生物量的GSH高密度发酵比生长速率控制策略研究将活细胞生物量传感器（型号Biomass monitor 220）成功地应用在复合培养基高密度补料发酵生产GSH过程中,建立了在线测量的电容值与细胞干重、OD600、活细胞计数和菌体离心体积计数法（Packed mycelia volume）这四种离线生物量检测方法的线性关系,确定了它们之间的线性方程和相关系数,其中电容值与活细胞数的相关系数达到0.995。相比较这四种离线方法,利用电容法来检测证明是一种在发酵过程中更方便准确的检测生物量的方法。因此,在复合培养基高密度补料分批发酵生产GSH过程中,Biomass monitor 220是一个非常有用的在线检测活细胞生物量的工具。GSH发酵过程比生长速率（μ）可通过电容值进行在线直接估算。对电容、OUR和CER这三种比生长速率估算方法进行比较,发现利用电容值来估算比通过OUR或CER这两种在线间接估算方法更为可靠实用。进一步将控制比生长速率反馈补料策略应用到GSH生产中,建立了GSH发酵过程在线控制比生长速率的有效优化方法。将比生长速率控制在0.2 h-’时,细胞密度和GSH发酵水平分别达到120 g/l和1.8 g/l,分别比控制比生长速率在0.15 h-1时提高了86.7%和200%。3.利用呼吸商（RQ）反馈控制技术建立了高密度补料发酵生产GSH过程中同时提高GSH产量和胞内GSH含量的发酵策略。采用RQ反馈控制葡萄糖补料速率,PID控制器将RQ控制在设定值。当RQ控制在0.65时使补料阶段的GSH和生物量生产效率最高,分别达到46.9 mg/l/h和3.5g/1/h,同时提高了GSH产量和胞内GSH含量。RQ控制使GSH最终产量达到2.1g/1、生物量126 g/l、胞内GSH含量1.67%和GSH生产率55.3 mg/l/h,分别比传统的乙醇反馈控制提高了75%、11.5%、57.5%和82.5%。并且RQ控制使副产物乙醇含量低于0.3 g/l。与传统的乙醇反馈控制相比,RQ控制能够降低副产物的形成,缩短发酵时间,并且有更高的GSH产量和胞内GSH含量等优势。通过代谢流分析表明,GSH合成途径通量显著增加是RQ控制高产的直接原因。此外还对补料成分进行优化,将补料培养基从只添加葡萄糖改为同时添加葡萄糖和酵母粉,使发酵水平得到进一步提高,GSH发酵产量达到2.4 g/l。因此,RQ反馈控制这种简单有效的控制方法有可能替代GSH生产中的传统反馈控制方法。4.GSH高产菌高产机理初步探索—γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH1）酶活和基因（gshl）序列比较分析对GSH高产菌株和野生菌株γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（GSH1）酶活和基因（gshl）序列比较分析,初步探索GSH高产菌高产的可能机理。结果表明：（1）高产菌GSH1酶活是野生菌的4倍,这表明有可能是高产菌的GSH1发生突变引起酶活变化。（2）对高产菌株中的gshl基因进行克隆测序,发现DNA序列上有13碱基发生突变,并引起相应的氨基酸序列的三处点突变,并都发生在此酶的保守结构域上和活性催化区域。（3）对GSH1的三维空间结构同源建模分析表明,这三处突变引起三维空间结构的改变,预测的结构势能也更低,这些结构上变化可能造成突变后的GSH1的空间结构更稳定,从而使酶活显著提高,最终细胞内的GSH含量明显提高。5..建立了在不破碎酵母细胞条件下乙醇原位高效提取GSH方法。对影响在不破碎酵母细胞条件下乙醇原位提取GSH的三个因素乙醇浓度、提取温度和提取时间进行考察,发现只有乙醇浓度是影响GSH提取效率的显著因素。接着采用单因素实验对乙醇浓度这个条件进行进一步优化,确定25%乙醇浓度提取效率最高,达到0.31%。把这个方法与目前GSH工业上常用的提取方法进行了比较,发现两者提取效率相当,但用乙醇提取的杂蛋白浓度更少。总体而言,这个方法环境友好和条件温和,有可能成为目前GSH工业上常用提取方法的一种替代方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 GSH性质和用途
• 1.1.1 GSH结构与性质
• 1.1.2 GSH的生理功能
• 1.1.3 GSH的生物合成
• 1.1.4 GSH的市场前景和国内外需求
• 1.2 GSH的生产方法
• 1.2.1 萃取法
• 1.2.2 化学合成法
• 1.2.3 酶法
• 1.2.4 发酵法
• 1.3 国内外微生物发酵法生产GSH研究进展
• 1.3.1 生产菌种选育
• 1.3.2 发酵条件优化
• 1.3.3 发酵调控策略
• 1.3.4 GSH提取技术进展
• 1.4 工业发酵过程优化与放大技术进展
• 1.4.1 发酵过程优化
• 1.4.2 发酵过程放大
• 1.5 本论文立题意义和主要内容
• 1.5.1 本论文立题意义
• 1.5.2 本论文主要研究内容
• 第二章 GSH高产菌菌种分子鉴定和环境胁迫生理特性研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 菌种培养与保藏方法
• 2.2.4 菌种环境胁迫生理特性分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 GSH高产菌的菌种分子鉴定
• 2.3.2 GSH高产菌环境胁迫生理特性研究
• 2.4 本章小结
• 第三章 基于在线活细胞生物量的GSH高密度发酵比生长速率控制策略
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株和培养基
• 3.2.2 补料分批发酵
• 3.2.3 离线检测方法
• 3.2.4 在线检测方法
• 3.2.5 数据分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 典型的GSH发酵过程特征
• 3.3.2 验证电容检测的有效性
• 3.3.3 采用电容检测酵母生物量（Biomass,X）线性关系
• 3.3.4 基于活细胞浓度检测的比生长速率在线估算
• 3.3.5 基于比生长速率在线估算的GSH高密度发酵
• 3.4 本章小结
• 第四章 RQ反馈控制同时提高GSH产量和胞内GSH含量及代谢流分析
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基和生长条件
• 4.2.3 培养方式
• 4.2.4 测定方法
• 4.2.5 S.cerevisiae生物合成GSH代谢网络结构模型
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 RQ反馈控制在GSH补料分批发酵过程特征
• 4.3.2 RQ反馈控制与GSH工业生产中最常用的乙醇反馈控制比较
• 4.3.3 补料成分改变对RQ反馈控制GSH发酵的影响
• 4.4 小结
• 第五章 GSH高产菌GSH1酶活比较与基因分析
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试剂
• 5.2.2 分子克隆仪器
• 5.2.3 菌种、质粒和引物
• 5.2.4 培养基
• 5.2.5 溶液配制
• 5.2.6 酵母总DNA制备
• 5.2.7 乙醇沉淀法回收DNA
• 5.2.8 DNA的PCR扩增
• 5.2.9 琼脂糖核酸电泳
• 5.2.10 目的片段回收
• 5.2.11 DNA定量与纯度检测
• 5.2.12 连接克隆载体
• 5.2.13 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 5.2.14 连接产物的转化
• 5.2.15 菌落PCR鉴定
• 5.2.16 质粒少量制备
• 5.2.17 DNA酶切反应
• 5.2.18 DNA测序和序列分析
• 5.2.19 对高产菌GSH1的分子建模和势能预测分析
• 5.2.20 GSH1酶活测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 GSH高产菌与野生酿酒酵母的GSH含量和GSH1酶活比较
• 5.3.2 GSH高产菌的GSH1的克隆与测序
• 5.3.3 GSH高产菌的GSH1的DNA和氨基酸序列比对分析
• 5.4 小结
• 第六章 在不破碎酵母细胞条件下利用乙醇原位高效提取胞内GSH
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 用乙醇或热水提取GSH
• 6.2.3 全因子实验设计
• 6.2.4 乙醇浓度对GSH提取的影响
• 6.2.5 检测方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 利用全因子实验设计优化乙醇提取条件
• 6.3.2 乙醇浓度对GSH提取的影响
• 6.3.3 乙醇提取方法与目前GSH工业上常用的提取方法比较
• 6.4 小结
• 第七章 总结与展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 论文主要创新点
• 7.3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士期间论文发表和获奖情况
• 卷内备考表