SNAREs蛋白和钾离子通道蛋白参与调节大菱鲆免疫应答

论文摘要

鳗弧菌是危害我国水产养殖业的主要病原菌.本文采用分子生物学,免疫学和膜片钳等技术,研究养殖鱼类-大菱鲆（Scophthalmus maximus）,在受到病原菌感染后,SNARE蛋白和钾离子通道参与免疫应答防御机制的调控作用。通过腹腔注射半致死剂量的鳗弧菌,研究受感染的大菱鲆在感染初期所诱发的一系列应激反应。通过鉴定外周血液白细胞的吞噬和杀灭鳗弧菌的活性,以及外周血、脾脏和头肾白细胞所发生的呼吸爆发的活性,血清中细胞因子-白介素1β的含量的变化,研究抗鳗弧菌的先天性免疫应答防御机制。结果发现在感染24hr后,白细胞吞噬鳗弧菌的百分数从47.25%增加到61.18%,吞噬鳗弧菌的指数从4.68增加到5.62;杀菌活性从1.26增加到1.73;呼吸爆发活性OD600值从0.07增加到0.2;比较外周血、脾脏和头肾白细胞三种组织所发生的呼吸爆发的活性发现,脾脏白细胞的呼吸爆发活性最高,头肾略高于血液,感染8hr后呼吸爆发活性平均大于1.7;血清中细胞因子-白介素1β的OD490值从正常鱼对照的0.0523±0.014增长到感染24hr的最大值0.47±0.033,感染24 hr后的表达量大约是未感染对照的9倍,感染后增加量显著（p<0.05）。进一步证明感染初期先天性免疫应答防御在保护鱼体中的重要作用。SNARE蛋白是一种参与调控所有真核生物细胞分泌和胞吐的膜蛋白。为了测定SNARE蛋白是否也参与大菱鲆白细胞的分泌和胞吐,首先通过RT-PCR方法鉴定大菱鲆体内存在的SNARE蛋白,设计两种SNARE蛋白（v-SNARE,VAMP-2和t-SNARE,SNAP-25）基因的引物,从外周血白细胞和脑组织中都克隆出SNAREs蛋白中的VAMP-2的cDNA,而SNAP-25的cDNA仅从脑组织中克隆出。经过序列分析发现,大菱鲆的VAMP-2基因与多数哺乳动物的VAMP-2基因同源性在80%以上,而氨基酸序列的同源性在90.6%以上;大菱鲆SNAP-25基因与多数哺乳动物的SNAP-25基因也在83%以上,氨基酸序列的同源性在89%以上。结果表明这两种SNARE蛋白在大菱鲆体内也是非常保守。为了证明SNARE蛋白是否参与调控大菱鲆白细胞细胞因子白介素-1β的分泌,研究分泌调控蛋白-SNAREs在大菱鲆先天性免疫应答过程中的作用。通过RT-PCR,免疫印迹,免疫组化技术克隆了大菱鲆VAMP-2基因,并研究了其在细胞因子白细胞介素-1β分泌中的调控作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1前言
• 1.1 鱼类免疫机制研究进展
• 1.1.1 鱼类免疫系统概述
• 1.1.2 鱼类细胞因子－白介素－1β
• 1.1.3 鱼类免疫机制研究进展
• 1.2 SNAREs 蛋白在免疫应答中作用的研究进展
• 1.2.1 SNAREs 蛋白在胞吐和分泌过程中的功能
• 1.2.2 SNARE 蛋白参与调控免疫细胞的胞吐
• 1.3 T淋巴细胞中钾离子通道的研究进展
• 1.3.1 T 淋巴细胞中钾离子通道的结构和种类
• 1.3.2 T 淋巴细胞中钾离子通道的表达变化
• 1.3.3 T 淋巴细胞中钾离子通道的生理作用
• 1.4 本研究的目的意义
• 2 大菱鲆（Scophthalmus maximus）抗鳗弧菌（Vibrio anguillarum）感染的免疫应答反应的研究
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 仪器与设备
• 2.1.2 材料与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大菱鲆血清和脾、头肾及血液白细胞的制备
• 2.2.2 大菱鲆白细胞吞噬鳗弧菌活性的测定
• 2.2.3 大菱鲆白细胞杀菌活性的测定
• 2.2.4 大菱鲆白细胞呼吸爆发活性的测定
• 2.2.5 大菱鲆血清中促炎症细胞因子IL-1β含量的测定
• 2.2.6 大菱鲆淋巴细胞增殖测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 大菱鲆白细胞吞噬鳗弧菌活性
• 2.3.2 大菱鲆白细胞杀菌活性
• 2.3.3 大菱鲆呼吸爆发活性
• 2.3.4 大菱鲆细胞因子IL-1β分泌
• 2.3.5 大菱鲆淋巴细胞增殖
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 3 大菱鲆 SNARE 蛋白基因的克隆和序列分析
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 仪器与设备
• 3.1.2 材料与试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 大菱鲆SNARE 基因扩增引物设计
• 3.2.2 RNA 的提取
• 3.2.3 cDNA 合成
• 3.2.4 PCR 扩增
• 3.2.5 PCR 产物克隆
• 3.2.6 测序结果验证
• 3.2.7 序列分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 RNA 的提取
• 3.3.2 PCR 扩增结果
• 3.3.3 测序结果
• 3.3.4 同源性分析
• 3.3.5 一级结构分析
• 3.3.6 二级结构预测
• 3.3.7 三维结构预测展示
• 3.3.8 疏水性分析
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 4大菱鲆 VAMP-2蛋白参与细胞因子 IL－1β分泌的调控
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 仪器与设备
• 4.1.2 材料与试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 鳗弧菌免疫鱼体
• 4.2.2 血清和白细胞的制备
• 4.2.3 血清中IL-1β含量的测定
• 4.2.4 IL-1β和 VAMP-2 的 RT-PCR
• 4.2.5 VAMP-2 的免疫印迹
• 4.2.6 VAMP-2 的激光共聚焦显微镜扫描
• 4.3 结果
• 4.3.1 受感染鱼白细胞IL-1β分泌
• 4.3.2 VAMP-2 基因在大菱鲆白细胞中表达
• 4.3.3 受鳗弧菌刺激的鱼体白细胞中 VAMP-2 蛋白的表达量增加
• 4.3.4 VAMP-2 定位于大菱鲆白细胞的分泌小泡上
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 5 大菱鲆钾离子通道参与调控淋巴细胞增殖的研究
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 仪器与设备
• 5.1.2 材料与试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 MTT 法检测钾离子通道阻断剂 TEA 和4-AP 对鳗弧菌感染72 小时后大菱鲆外周血淋巴细胞增殖的影响
• 5.2.2 鳗弧菌感染前后大菱鲆外周血淋巴细胞钾离子通道变化的检测
• 5.3 结果
• 5.3.1 淋巴细胞的贴壁
• 5.3.2 通道阻断剂 TEA 和 4-AP 对淋巴细胞增殖的影响
• 5.3.3 受鳗弧菌感染前后大菱鲆淋巴细胞钾离子通道特性
• 5.3.4 通道阻断剂 TEA 和 4-AP 对淋巴细胞钾离子通道的影响
• 5.4 讨论
• 5.5 结论
• 本论文创新点
• 发表文章
• 参考文献
• 致谢