黄酒酒药菌群分析、优良菌种筛选及混合菌株发酵研究

论文摘要

本论文以黄酒酒药为研究对象,应用传统微生物发酵技术结合现代分子生物学技术,现代仪器分析技术,采用理化指标分析对黄酒酒药中的微生物区系,优良发酵菌种的筛选和混合菌种发酵过程中各成分的动态变化等方面进行了系统深入的研究。1.采用多种分离培养基对黄酒酒药中的酵母菌、细菌和霉菌分离纯化。从28条随机引物中筛选3条随机引物建立组合分型的RAPD分子分型方法。从3种酒药（DYT、HST和HSG）分离纯化出132株酵母菌,并对其进行RAPD指纹图谱分析,共获得22个RAPD基因型,通过UPGMA聚类分析聚成9个遗传谱系,随机选取不同基因型的酵母菌株进行26S rDNA D1/D2区序列分析并构建系统进化树。经鉴定3种酒药中的酵母菌主要是酿酒酵母、费比恩毕赤酵母、密西西比毕赤酵母和葡萄牙棒孢酵母,酵母菌株之间存在较大的种内遗传多态性,显示不同的亲缘关系。酒药DYT、HST和HSG的优势酵母菌分别是费比恩毕赤酵母、酿酒酵母和葡萄牙棒孢酵母。接下来对216株细菌分离株进行RS-PCR分子分型,并对其进行16S rRNA序列分析,鉴定酒药中芽孢杆菌属细菌为优势细菌,酒药中细菌种类包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、产酸克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和乳酸球菌；最后对168株霉菌进行ITS序列分析,鉴定3种酒药的主要微生物均包括伞枝犁头霉、黄曲霉和米曲霉,此外还分离到微小毛霉、黑曲霉、塔宾曲霉、桔青霉和小孢根霉。2.对酵母菌分离株分别采用TTC平板显色、杜氏管法初筛、发酵法复筛,通过耐酒精、致死温度性能指标的实验比较,最终筛选到一株优良酿酒酵母HSTY-30,其遗传性状稳定,生长均一快速,生理耐性好,发酵力高,产酒精度为8.93g/100mL残糖为1.2g/L,致死温度为56℃,耐酒精度为16%（v/v）,酸度适中,香气较好。对霉菌分离株采用糖化透明圈法结合酶活力测定筛选,最终选育到一株优良米曲霉DYT-30,其产糖化酶、α-淀粉酶、蛋白酶活力分别为1678u/g曲、68.6u/g曲和839.9u/g曲。3.研究黄曲霉、米曲霉、伞枝犁头霉、黑曲霉、桔青霉和小孢根霉混合发酵技术,测定混合霉菌的糖化力、液化力、蛋白酶活力和纤维素酶活力,并对混合菌种发酵与传统酒药发酵过程中各成分的动态变化进行了研究。结果表明,黄酒混合菌种发酵过程中,表现出类似传统酒药发酵过程中各成分的动态变化趋势：pH明显下降和酸度上升；发酵品温先缓升,再缓降,最高达34℃左右。相较于传统酒药发酵的黄酒,混菌发酵的黄酒氨基酸态氮、总多酚含量和出酒率增加,酒精度和总酯含量有所下降。采用顶空固相微萃取-气相色谱法检测黄酒中部分特征醛、酯和醇类挥发性物质,研究显示,混菌发酵的黄酒和传统酒药酿制的黄酒的挥发性风味物质的种类和各风味物质成分的含量具有明显差异,部分混合菌种组合与传统酒药酿制黄酒的醇和酯在挥发性成分中相对含量和醇酯比具有很大相似性,基本达到传统酒药酿制黄酒的风味组成。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩写符号说明
• 第一章 绪论
• 1 黄酒简介
• 1.1 黄酒的营养价值和保健功能
• 1.2 黄酒的发酵特点
• 1.2.1 开放式发酵
• 1.2.2 双边发酵
• 1.2.3 浓醪酿造
• 1.2.4 低温长时间发酵
• 2 黄酒酒药研究
• 2.1 酒药的工艺流程
• 2.2 酒药中的微生物研究
• 3 黄酒发酵微生物选育研究
• 4 微生物分子分类鉴定的研究
• 4.1 分子分型技术
• 4.1.1 RFLP分型技术
• 4.1.2 AFLP分型技术
• 4.1.3 PFGE分型技术
• 4.1.4 ERIC-PCR分型技术
• 4.1.5 RS-PCR分型技术
• 4.1.6 REP-PCR分型技术
• 4.1.7 RAPD分型技术
• 4.2 分子鉴定
• 4.2.1 细菌16S rRNA序列分析
• 4.2.2 真菌rDNA序列分析
• 5 论文研究目的意义和主要内容
• 5.1 本研究的目的意义
• 5.2 论文的主要内容
• 第二章 黄酒酒药菌群分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 仪器与设备
• 1.1.4 培养基制备
• 1.1.5 主要试剂配制
• 1.1.6 引物序列
• 1.2 酒药中酵母菌分离纯化及分子鉴定方法
• 1.2.1 酵母菌的分离、纯化
• 1.2.2 基因组DNA的提取
• 1.2.3 酵母菌DNA纯度及浓度检测
• 1.2.4 RAPD扩增以及随机引物的筛选
• 1.2.5 RAPD重复-性实验
• 1.2.6 酵母菌聚类分析
• 1.2.7 26S rDNA D1/D2区的扩增及测序
• 1.2.8 系统进化树的构建和分析
• 1.3 酒药中细菌分离纯化及分子鉴定方法
• 1.3.1 细菌的分离、纯化
• 1.3.2 细菌基因组DNA的提取
• 1.3.3 细菌DNA纯度及浓度检测
• 1.3.4 细菌RS-PCR扩增
• 1.3.5 16S rDNA PCR扩增及测序
• 1.3.6 细菌系统进化树的构建和分析
• 1.4 霉菌分离纯化及分子鉴定方法
• 1.4.1 霉菌的分离、纯化
• 1.4.2 霉菌基因组DNA的提取
• 1.4.3 霉菌DNA纯度及浓度检测
• 1.4.4 ITS-PCR扩增
• 1.4.5 霉菌系统进化树的构建和分析
• 2 结果与分析
• 2.1 酒药中酵母菌菌群分析
• 2.1.1 酵母菌株的分离纯化
• 2.1.2 酵母基因组DNA纯度鉴定
• 2.1.3 RAPD随机引物的筛选结果
• 2.1.4 RAPD分型结果
• 2.1.5 26S rDNA D1/D2区的扩增结果
• 2.1.6 序列比较分析和系统进化树构建
• 2.1.7 不同酒药中酵母菌种群结构
• 2.2 酒药中细菌菌群分析
• 2.2.1 细菌的分离纯化
• 2.2.2 RS-PCR分子分型结果
• 2.2.3 16S rDNA PCR扩增结果
• 2.2.4 序列比较分析和系统进化树构建
• 2.2.5 不同酒药中细菌种群结构
• 2.3 酒药中霉菌菌群分析
• 2.3.1 霉菌的分离纯化
• 2.3.2 ITS-PCR扩增结果
• 2.3.3 序列比较分析和系统进化树构建
• 2.3.4 不同酒药中霉菌种群结构
• 3 讨论
• 3.1 微生物的分子分型和分子鉴定
• 3.2 黄酒酒药中微生物群落结构
• 第三章 黄酒优良发酵菌种筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 仪器与设备
• 1.1.4 培养基制备
• 1.1.5 主要试剂配制
• 1.2 酵母菌筛选方法
• 1.2.1 酵母菌的一级筛选
• 1.2.2 酵母菌的二级筛选
• 1.2.3 酵母菌的三级筛选
• 1.3 霉菌筛选方法
• 1.3.1 霉菌的初筛
• 1.3.2 霉菌的复筛
• 2 结果与分析
• 2.1 优良酵母菌的筛选
• 2.1.1 TTC法筛选
• 2.1.2 杜氏管发酵筛选
• 2.1.3 酵母菌发酵力测定
• 2.1.4 性能指标测定
• 2.2 优良霉菌的筛选
• 2.2.1 透明圈法初筛
• 2.2.2 霉菌的酶活力复筛
• 3 讨论
• 第四章 混合霉菌发酵研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 仪器与设备
• 1.1.4 培养基制备
• 1.1.5 主要试剂配制
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 混合霉菌的固态培养
• 1.2.2 干黄酒酿制工艺流程
• 1.3 酶活力测定方法
• 1.3.1 糖化力的测定
• 1.3.2 液化力的测定
• 1.3.3 蛋白酶活力的测定
• 1.3.4 纤维素酶活力测定
• 1.4 发酵过程中指标测定方法
• 1.4.1 总酸的测定
• 1.4.2 品温的测定
• 1.4.3 pH的测定
• 1.4.4 总糖含量的测定
• 1.4.5 水分含量的测定
• 1.5 成品黄酒项指标测定方法
• 1.5.1 总酯的测定
• 1.5.2 酒中固形物的测定
• 1.5.3 氨基酸态氮含量的测定
• 1.5.4 酒度（乙醇）含量的测定
• 1.5.5 总多酚含量的测定
• 1.5.6 挥发性香气成分的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 混合霉菌的酶活力
• 2.2 传统酒药和混合菌种发酵过程中指标变化
• 2.2.1 发酵过程中品温的变化
• 2.2.2 发酵过程中酒醅pH值的变化
• 2.2.3 发酵过程中酒醅水分含量的变化
• 2.2.4 发酵过程中酒醅总酸的变化
• 2.3 混合菌种发酵黄酒理化指标
• 2.4 黄酒的总酯和氨基酸态氮含量
• 2.5 黄酒的总多酚含量
• 2.6 挥发性香气成分的测定
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 附录1 菌株基因片段序列
• 附录2 成品黄酒挥发性物质气相色谱图
• 致谢