论文摘要
颌面部骨折是口腔颌面外科的常见病和多发病。随着我国交通事故的发生率逐年递增,颌面部骨折的发生率也逐年增加。对颌面部骨折的诊治的研究已成为国内外研究的热点之一。颌面部骨折同全身其他部位骨折相比,其独特性有:复位和固定时要求更严格;在复位固定后,也往往因限制进食影响到骨折的愈合;必须在功能恢复的基础上满足患者对外观的要求。因此,颌面部骨折的治疗必须要求严格的复位和固定,并力求骨折尽可能快地愈合。分子生物学研究表明,骨折愈合是一个多种细胞生长因子参与调控的复杂过程,其中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）和骨形成蛋白-2 （bone morphogenetic protein-2, BMP-2）与骨折愈合密切相关。bFGF对成骨细胞、成软骨细胞的增殖和分化都有明显的刺激作用,因而在骨折愈合过程中发挥重要作用。BMP-2是骨折修复时的启动因子,通过调控细胞核内相关基因的表达,诱导细胞的分化从而促进软骨及骨的形成。分子创伤学的发展使采用外源性细胞生长因子加速骨折愈合成为可能。但目前有关采用细胞生长因子加速颌骨骨折愈合的研究结果都存在着一定的缺陷,表现为细胞生长因子一方面生物活性大,生理作用强。另一方面体内半衰期短,清除率高,非注射给药生物利用度低,不能持续有效的促进骨折愈合。为此一些学者采用骨折局部注射BMP-2和bFGF,或者研制多种缓释bFGF和BMP-2载体材料等方法试图解决这一难题,但都存在bFGF和BMP-2降解快,效果短暂,操作复杂,不能稳定而持久地发挥作用等情况。纳米技术是一门在纳米级的尺度下,对物质进行制备和工业化,并相互交叉发展的综合性的科技体系。纳米微球被器官或组织吸收,能显著延长药效、提高利用度。通过对包裹材料的调控,可以实现纳米微球在体内的缓释和靶向分布。基于以上分析,结合国内外研究进展,本课题通过药剂学实验,采用聚乳酸（polylactic acid,PLA）为包裹材料,制备bFGF- PLA纳米微球（bFGF-PLA-Ns）、rhBMP-2-PLA纳米微球（rhBMP-2-PLA-Ns）,探讨bFGF和BMP-2缓释系统加速颌骨骨折愈合的方法。我们将bFGF-PLA-Ns,rhBMP-2-PLA-Ns胶体液分别制成冻干粉剂和凝胶,研究微球药物形态和粒经分布;载药量和包封率;体外缓释时间、缓释方程和生物学特性等。通过原代培养兔成骨细胞,探讨bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞的生物学效应。观察不同浓度bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞增殖的影响;对增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的作用;对碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性和对矿化度的影响;在rhBMP-2-PLA-Ns干预下,探讨成骨细胞对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表达的影响。建立兔下颌骨骨折模型,分别通过HE染色,免疫组化研究PCNA和Ⅷ因子相关抗原的变化,四环素荧光染色新骨的生成,原位杂交研究rhBMP-2-PLA-Ns对VEGF的作用等方法,探讨bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对兔下颌骨骨折愈合的作用。实验方法和结果:1、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns的制备和其物理、化学特性:PLA纳米微球制备:Malvern激光粒度分布测试仪测定三组PLA胶体平均粒径分别为161nm,154nm,160nm,达到实验要求。对bFGF和rhBMP-2进行精密度、二氯甲烷和丙酮混合物中稳定性测定,证实bFGF和rhBMP-2精密度和稳定性可靠。采用复乳-干燥法（w/o/w）将bFGF和rhBMP-2制备成bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2- PLA-Ns,通过电镜和Malvern激光粒度分布测试仪测定,显示微球的粒茎为30～50nm,该纳米微球表面光滑圆整,球体大小均匀,粒径分布范围窄。通过处方优化采用1%乳糖作为支架剂,载药量和包封率研究证实bFGF-PLA-Ns包封率和载药量分别为91.72±1.31%和[（27.65±0.44）×10-3]%,rhBMP-2-PLA-Ns包封率和载药量分别为90.54±1.32%和[（124.73±0.41）×10-3]%。模拟体内环境研究表明,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns在14d内,不仅一直持续释放bFGF和rhBMP-2,而且所释放出的bFGF和rhBMP-2浓度可以保持在一定的水平。平均浓度分别是bFGF-PLA-Ns为（72.47±6 .26）ng/ml,rhBMP-2-PLA-Ns为（73.44±5.38）ng/ml。以累积释放率和时间进行拟合,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns的体外释药规律均符合Higuichi方程,分别为:Q=27.7636t1/2-13.4247,r=0 9975,Q=26.7687t1/2-12.3283,r=0 9962。2、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞体外生物学效应研究:兔成骨细胞原代培养并进行形态观察和鉴定。观察bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞的增殖效应（MTT法）。结果提示,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns微球均能显著的增加成骨细胞的增殖（p<0.05）。茜素红染色研究表明,bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns都对矿化结节的形成有显著的刺激作用（p<0.05）。通过对成骨细胞ALP活性的研究,证实bFGF-PLA-Ns能显著促进成骨细胞的分化（p<0.05）。免疫组化研究bFGF-PLA-Ns对成骨细胞增殖细胞核抗原（PCNA）的表达影响,结果表明bFGF-PLA-Ns能增强PCNA活性（p<0.05）;免疫荧光研究rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞PCNA表达影响,表明rhBMP-2-PLA-Ns能增强PCNA活性。Western blot研究rhBMP-2-PLA-Ns对成骨细胞VEGF表达的影响,结果表明rhBMP-2-PLA-Ns可以刺激成骨细胞自分泌VEGF的增加。3、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns促进下颌骨骨折愈合的动物实验:建立兔下颌骨骨折模型,实验分为5组,设立空白组,单纯bFGF组,bFGF-PLA-Ns凝胶试验组,单纯rhBMP-2组和rhBMP-2-PLA-Ns凝胶试验组。分别在术后1周,2周,4周,8周处死动物。对骨折断段病理切片行HE染色观察。结果提示:与空白组和对照组相比,试验组术后1周有新生骨小梁形成;术后2周有较多编织骨形成,成熟度高;术后4周编织骨进一步增多、成熟、融合,可见大量新生血管和继发性骨痂形成,骨痂比例明显高于空白组和对照组。原位杂交检测VEGF mRNA的阳性表达证实,rhBMP-2-PLA-Ns实验组要高于空白组和对照组（P<0.05）。骨折断段病理切片PCNA免疫组化研究结果证实,实验组与对照组、空白组相比,在1、2周PCNA阳性细胞增多（P<0.05）。病理切片血管内皮细胞行Ⅷ因子相关抗原免疫组化研究表明,bFGF-PLA-Ns能够刺激血管内皮细胞Ⅷ因子相关抗原的高表达。四环素荧光证实bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns实验组均可以加快新骨的形成,有统计学意义。结论:1、以PLA为载体,采用复乳-干燥法（w/o/w）制备的bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns达到纳米微球的各项要求,各项组成无免疫原性,具备良好的生物安全性。2、实验采用的微球制备方法和工艺确实可行。通过中国、美国、欧盟、日本等专利检索,“碱性成纤维生长因子聚乳酸缓释纳米微球凝胶及其制备方法”具有原创性,已经申请中国知识产权局技术发明专利（申请号:200610095316.9）。3、体外研究表明bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns对兔成骨细胞具有明显的生物学效应。4、bFGF-PLA-Ns和rhBMP-2-PLA-Ns凝胶能够促进兔下颌骨骨折愈合,表明其在加速骨折愈合上具有良好的临床应用前景。
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