大鼠动脉粥样硬化及氟伐他汀干预后差异表达基因研究 ——对HSP60、ADMR表达的影响

论文摘要

研究目的建立大鼠动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）模型,应用氟伐他汀进行干预,通过基因芯片技术,分别研究在动脉粥样硬化过程中以及药物干预后基因表达的变化,为动脉粥样硬化的防治提供理论依据。材料与方法1普通级SD雄性大鼠45只,随机分为3组,每组15只。A组,空白对照组;B组,AS组;C组,氟伐他汀干预组。A组喂养基础饲料;B组喂养高脂饲料（基础饲料+3%胆固醇、0.5%胆酸钠、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶和5%精制糖）+维生素D3;C组在喂养高脂饲料+维生素D3基础上,给予氟伐他汀20mg/kg/天/只,自来水lml配制,灌胃。实验周期为12周。2实验开始时及进程中动态检测各组血清甘油三脂（TG）,总胆固醇（TC）及血钙含量。3 12周末处死存活大鼠,留取标本制作切片备HE染色,剩余标本置于液氮中速冻后-80℃保存,备用。4取出液氮保存的各组主动脉组织进行表达谱的基因芯片分析,筛选差异表达基因。5从芯片分析结果中筛选HSP60、ADMR作为目的基因进行重点研究。6应用RT-PCR和Western blot等方法和技术观察各组大鼠主动脉组织HSP60、ADMR的表达特点。结果1 AS大鼠模型的制备实验过程中C组大鼠饲养中1只死亡;B组大鼠1只AS模型未制备成功,1只死亡。2各组大鼠体重、血脂、血钙比较0周时3组大鼠各指标差异无统计学意义。随饲养时间延长,A组、C组大鼠体重逐渐增加,以A组增加明显;B组大鼠的体重在最初8周增长,到12周增长减缓;但组间差异无统计学意义。血TG,TC和血钙浓度的变化经组间方差分析各组间存在差异,与A组相比,B组TG、TC明显升高（ P<0.05） ;与B组相比,C组TG,TC显著下降（P <0.01）。与A组相比,B组、C组血钙均明显升高（ P<0.05）。3各组大鼠主动脉病理改变（HE染色）:A组血管壁三层结构清晰,内膜光滑、薄,未见斑块生长;中膜平滑肌细胞排列整齐,排列规整与内弹力板平行。B组血管壁三层结构欠清晰,内膜粗糙、缺损不完整,细胞排列紊乱,中膜平滑肌增生、断裂,排列不规则,纤维组织增生,弹性纤维层结构不清,在纤维帽深部可见大量钙化灶及无定形物质,形成纤维增生性动脉粥样硬化斑块。C组血管病理介于A组与B组之间,血管壁三层结构尚清晰,内膜比较完整、欠光滑;可见钙化灶及无定形物质,但明显小于B组,平滑肌细胞排列尚整齐。4 22575点基因芯片实验结果:B组与A组相比,上调表达的基因分别有610条,下调表达的基因分别为1018条,其中上调表达的基因包括了分子调控炎性反应基因（TNF-α、MCP-1、NF-κB等）、生长相关分子基因（TGFβ1、bFGF等）、凝血相关分子基因（TF等）、细胞增殖相关分子基因（PCNA等）、应激相关分子基因（HSP60等）及其他种类基因（如ADMR）;C组与B组相比,上调表达的基因有2255条,下调表达的基因有844条,其中下调表达的基因包括炎性反应基因（如TNF-α、MCP-1）、生长相关分子基因（如TGFβ1、bFGF）、凝血相关分子基因（如TF）、细胞增殖相关分子基因（如PCNA）等,上调表达的基因例如ADMR、PGM1等。5 HSP60 mRNA的表达:B组较A组明显升高（P<0.05）,C组较B组无明显差异（P>0.05）。6 ADMR mRNA和蛋白的表达:B组较A组明显升高,C组较B组显著升高（P<0.05）。结论1采用高脂饮食+维生素D3的方式,成功建立了实验性AS的动物模型。2对AS大鼠进行的基因芯片的表达谱分析结果表明,与A组相比,B组主动脉组织基因表达产生了严重紊乱,多种基因表达得以上调和下调,这些差异性表达基因分别与炎症、凝血、氧化应激、细胞增殖等相关。说明AS的发病机制非常复杂,有多种因素参与。3对AS大鼠进行氟伐他汀干预的基因芯片的表达谱分析结果表明,与B组相比,C组基因表达产生了新的变化,和炎症、凝血、细胞增殖有关的多种基因表达下调。进一步验证了他汀类药物的“多效性”。4 AS过程中可检测到HSP60表达升高,氟伐他汀干预后其表达变化不明显。5 HSP60可能是与血脂水平无关的动脉粥样硬化预测因子,可能未参与氟伐他汀抗AS的分子机制。6 AS过程中可检测到ADMR表达升高,氟伐他汀干预后ADMR基因表达进一步升高,提示ADMR可能参与了氟伐他汀抗动脉粥样硬化的作用机制。综上所述,本实验应用基因芯片技术证明AS的发病是由多因素作用多基因改变而引发的复杂病变;大鼠可以作为复制AS的模型;他汀类药物具有重要的调脂外多重作用,即“多效性”。由此可见,本项研究的结果有望为AS的防治提供新思路和理论依据。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一：基因表达谱芯片筛选AS 大鼠及氟伐他汀干预后差异表达基因
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验二：氟伐他汀对AS 大鼠HSP60 基因表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 实验三：氟伐他汀对AS 大鼠ADMR 基因表达的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢