H9N2亚型猪流感病毒M1、NS1、NP基因的原核表达和NP-ELISA检测技术的研究

论文摘要

猪流感（ Swine influenza, SI）是由猪流感病毒（ Swine influenza virus, SIV）引起的不同日龄、性别和品种猪的一种急性、热性和高度接触性的呼吸道传染病。其特征为疾病突发,高热,精神沉郁,食欲废绝,呼吸困难,阵发性咳嗽。SI的病死率不高,病猪可迅速康复,但是随着集约化养猪规模的不断扩大,SI对养猪业构成了较大的威胁。1918年美国首次报道了SI的暴发,1930年Shope从猪体中分离到了H1Nl亚型SIV。迄今为止,SI已遍布美、欧、亚、非等世界各地。SI除具有兽医学意义外,更为重要的是生态学和公共卫生意义。目前,SI已成为研究的热点。研究快速、科学、准确的诊断方法对于本病的检测和控制具有很大的意义。本研究用接种鸡胚的病毒增殖方法大量增殖分离株A/swine /Hangzhou/1/2006 （H9N2）,增殖病毒经差速离心进行纯化,经超速离心浓缩。根据Genbank发表的SIV结构蛋白M1、NP和非结构蛋白NS1基因核苷酸序列,设计1条通用引物Unit,进行反转录获取cDNA;设计特异性引物Pm1/ Pm2、Pnp1/ Pnp2、Pns1/ Pns2用以扩增M1、NP和NS1基因。通过PCR技术,从病毒基因反转录产物cDNA中扩增出病毒结构蛋白M1、NP和非结构蛋白NS1目的基因片段,将其克隆到pMD18-T载体,然后定向克隆到表达载体pET-28a中。提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。将重组质粒pET-M1,pET-NS1和pET-NP转化到表达宿主菌BL21 （DE3）/ Rosetta TM（DE3）中,经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导,高效表达了M1、NP和NS1蛋白,分子质量约为31.4 kD、55.1kD和27kD。经Western-Blot检测表明,表达的重组蛋白均能够被SIV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。此结果为SI新型免疫学诊断试剂以及亚单位疫苗的研制奠定了基础。用纯化的H9N2亚型SI可溶重组NP蛋白作为包被抗原,建立了检测SI抗体的间接ELISA方法,并确定了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度为12.5μg/ml,37℃1 h加4℃过夜,血清（1∶40）和SPA （1∶10000）分别在37℃温育40 min,底物溶液37℃显色15 min。经重复性试验、交叉试验、竞争抑制试验等试验结果表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高;利用TG-ROC软件确定了自制ELISA （NP-ELISA）酶标板的临界值为0.20,特异性和敏感性分别为95.83%和91.43%。与美国IDEXX试剂盒相比较,符合率为94%,无显著性差异。用已建立的ELISA方法检测临床血清样本356份,总阳性率为35.40%。为进一步组装成诊断试剂盒奠定物质基础,为SIV的诊断与监测提供了一种良好的技术手段。

论文目录

• 英文缩略表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 一 猪流感概述
• 1 病毒的理化特性与结构
• 1.1 病毒的理化特性
• 1.2 病毒的形态结构
• 1.3 病毒的基因组结构
• 2 病毒生物学特性
• 2.1 血凝特性
• 2.2 抗原性
• 2.3 增殖特性
• 2.4 病毒的变异
• 3 病毒的编码蛋白
• 3.1 血凝素蛋白
• 3.2 神经氨酸酶蛋白
• 3.3 聚合酶蛋白
• 3.4 核蛋白
• 3.5 基质蛋白
• 3.6 非结构蛋白
• 4 SIV 的复制
• 4.1 病毒粒子的侵入与脱壳
• 4.2 转录
• 4.3 SIV 基因组的复制
• 4.4 SIV 基因表达的调控
• 4.5 病毒的装配及释放
• 5 猪流感的世界流行及公共卫生意义
• 5.1 猪流感的世界流行情况
• 5.2 猪流感的公共卫生意义
• 二 猪流感诊断技术
• 1 流感病毒的分离和鉴定
• 1.1 病毒的分离
• 1.2 病毒的鉴定
• 2 猪流感的血清学诊断方法
• 2.1 血凝和血凝抑制试验
• 2.2 神经氨酸酶抑制试验
• 2.3 中和试验
• 2.4 琼脂凝胶扩散试验
• 2.5 免疫荧光法
• 2.6 酶联免疫吸附试验
• 2.7 免疫过氧化酶单层细胞试验
• 3 猪流感的分子生物学诊断方法
• 3.1 聚合酶链式反应
• 3.2 实时荧光定量 PCR
• 3.3 NASBA 法
• 4 流感的其他诊断方法
• 三 小结
• 研究内容
• 第一章 H9N2亚型猪流感病毒 M1、NS1基因的原核表达
• 1 材料
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 工具酶及主要试剂
• 1.3 常用缓冲液及培养基配置
• 2 方法
• 2.1 猪流感 M1、NS1 基因的原核表达载体的构建与序列分析
• 2.2 原核表达、鉴定及表达条件优化
• 2.3 重组表达蛋白的纯化
• 2.4 表达蛋白的免疫原性分析
• 3 结果
• 3.1 M1、NS1 基因的扩增及 M1 基因 T-载体的克隆
• 3.2 pET-M、pET-NS1 的克隆及鉴定
• 3.3 pET-M 基因的克隆及鉴定
• 3.4 M1、NS1 基因表达及重组蛋白的纯化
• 3.5 重组表达蛋白 Western-blot 检测
• 3.6 重组表达蛋白 NS1 ELISA检测
• 4 讨论
• 第二章 H9N2 亚型猪流感病毒NP基因的原核可溶表达
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 猪流感NP基因的原核表达载体的构建与序列分析
• 2.2 原核表达、鉴定及表达条件优化
• 2.3 重组NP蛋白的非变性Ni-NTA 纯化
• 2.4 表达蛋白的免疫原性分析
• 3 结果
• 3.1 NP基因的扩增、克隆及鉴定
• 3.2 pET-NP重组质粒的鉴定
• 3.3 NP基因的表达
• 3.4 重组蛋白NP的可溶性分析
• 3.5 重组蛋白NP的非变性纯化
• 3.6 NP表达蛋白的Western－blot检测
• 4 讨论
• 第三章 重组NP蛋白抗原检测SIV抗体间接ELISA的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂
• 1.2 血清及病毒
• 1.3 重组 N 蛋白抗原最适包被浓度和抗体最佳稀释度的确定
• 1.4 抗原包被条件的确定
• 1.5 封闭液的确定
• 1.6 封闭时间的确定
• 1.7 血清最佳反应时间的确定
• 1.8 酶标二抗（SPA）工作时间的确定
• 1.9 间接 ELISA 操作程序和结果判定
• 1.10 特异性试验
• 1.11 重复性试验
• 2 结果
• 2.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定
• 2.2 重组 N 蛋白抗原包被条件的确定
• 2.3 封闭液的确定
• 2.4 封闭时间的确定
• 2.5 血清最佳反应时间的确定
• 2.6 酶标 SPA 工作时间的确定
• 2.7 间接 ELISA 判定标准的确定
• 2.8 特异性试验
• 2.9 重复性试验
• 2.10 与 IDEXX 公司试剂盒比较试验
• 2.11 临床血清样本的检测
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录A 常用缓冲液及溶液配制
• 附录B：仪器及试剂
• 附录 C:SIV M1、NP、NS1 基因克隆表达技术路线
• 攻读学位期间发表的论文