功能基因芯片（GeoChip）在两种典型环境微生物群落分析中应用的研究

论文摘要

微生物在自然界无处不在,而且其参与并承担着重要的生态功能,从碳、氮循环,到矿物形成和风化,无一不与微生物相关。但是,目前,自然界约99%的微生物因有限的培养基和特异的生长条件而尚未被培养,因此如何准确描述和定量自然环境中的微生物群落及其同环境因素之间的关系,是环境微生物生态学的重要研究课题之本研究主要以功能基因芯片（GeoChip）在环境微生物群落分析中应用为研究主线,分别从环境样品DNA的提取与纯化和GeoChip在两种典型环境微生物群落分析中的应用为支线,对GeoChip在环境微生物群落分析中的应用展开了一系列的具体研究与探讨。除了GeoChip技术,本研究还采用了其他诸如克隆文库、BIOLOG. PLFA和土壤呼吸仪等技术手段作为辅助手段,对研究对象进行了全面的分析与研究。本研究的主要结果如下：第一,经过136个土壤样品的纯化测试表明,本研究改进后的低融点胶纯化环境样品DNA的方法,可以从各种污染程度的环境样品中获得高质量、大片段（>23 kb）的DNA,且均能够用于全基因组放大、标记和杂交；第二,来自三座铜矿山的酸性矿坑水（acid mine drainage, AMD）中的微生物群落结构相对较简单,且不同AMD样品中微生物群落结构差异较大,其中的微生物主要由α-,β-和y-Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Cyano-bacteria, Firmicutes, Proteobacteria, Planctomycetes, Bacteriodetes和Nitrospirae组成；虽然GeoChip2.0芯片从AMD生态系统中检测到较少的功能基因,但检测到的功能基因几乎涉及到所有的基本生物地球化学循环过程,而且,多元统计分析表明,AMD中的微生物群落组成主要受周围环境地化参量的影响；第三,GeoChip检测到气候变暖的加温效应导致地表微生物群落功能基因的丰度增加,土壤微生物的群落结构受到了显著的影响,而采割处理（用来模仿收获地表植被生物量,并用于生物能源）增强了加温处理导致的温度增加作用,但降低了微生物群落的分散度（结构,多样性,丰度）和功能基因（碳,氮,磷,硫循环基因）的丰度,差异分解分析表明,除土壤温度以外,土壤和植物变量可以解释79.4%的总变异,表明土壤温度升高通过影响土壤和植物变量而影响土壤中微生物群落结构的。总而言之,通过GeoChip对两种典型环境（极端酸性水环境和气候变暖下的土壤环境）中微生物的群落结构的研究,我们认为,GeoChip作为一种宏基因组学研究技术,其为环境微生物,尤其是在环境微生物功能基因组学方面的研究,提供了一个强有力的工具,它能够在功能基因水平上研究环境微生物群落结构和功能基因的变化,进而推断环境中可能存在或变化的生态功能,并且,通过多元统计分析环境参量同基因芯片数据的相互关系,可以使我们更好的认识环境微生物同环境参量的相互作用关系。该技术加深了人们对环境微生物功能变化及其与环境参量之间相互关系的认识。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 宏（环境微生物）基因组学
• 1.1.1 全基因组鸟枪法测序
• 1.1.2 基因芯片
• 1.1.3 焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术
• 1.2 国内外研究进展
• 1.2.1 环境微生物总基因组的提取与纯化研究
• 1.2.2 酸性矿坑水中微生物群落的研究
• 1.2.3 气候变化对土壤环境微生物群落研究
• 1.3 GeoChip的特点及其在环境微生物群落分析中的应用
• 1.4 本研究的目的、内容、技术路线和创新性
• 1.5 展望
• 第二章 环境样品总DNA的提取及纯化方法比较的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 样地信息与实验样品采集
• 2.2.2 DNA提取程序
• 2.2.3 改进后的胶纯化方法
• 2.2.4 DNA的定性与定量
• 2.2.5 比较低pH PIPES缓冲液和Tris-HCl缓冲液
• 2.2.6 粗DNA纯化的比较
• 2.2.7 比较Tris-HCl缓冲液加改进胶纯化方法和PIPES缓冲液加Promega试剂盒纯化方法
• 2.2.8 PCR放大
• 2.2.9 全基因组滚环放大（Rolling circle amplification,RCA）、标记和杂交
• 2.2.10 改进后胶纯化的通用性
• 2.3. 结果
• 2.3.1 比较低pH PIPES DNA抽提缓冲液和Tris-HCl DNA抽提缓冲液
• 2.3.2 DNA纯化方法的比较
• 2.3.3 低溶点胶纯化方法的适用性
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 德兴、银山和永平三座铜矿山酸性矿坑水中微生物群落系统发育的分析研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 样地描述和取样
• 3.2.2 DNA提取与纯化
• 3.2.3 16S rDNA基因PCR扩增、纯化、克隆和测序
• 3.2.4 序列系统发育分析
• 3.2.5 数据统计及分析
• 3.2.6 核苷酸序列登记号
• 3.3 结果
• 3.3.1 样品地球化学参量特征
• 3.3.2 AMD中微生物群落系统发育分析
• 3.3.3 微生物群落组成结构和地球化学参量、空间距离的关系
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 德兴、银山和永平三座铜矿山酸性矿坑水中微生物群落功能基因的分析研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.2.1 样地描述、样品采集和地化参量分析
• 4.2.2 样品中微生物群落总DNA提取与纯化（详见3.2.2）
• 4.2.3 样品中微生物群落总DNA全基因组放大、标记、芯片杂交和扫描
• 4.2.4 芯片数据预处理
• 4.2.5 数据统计及分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 样品地化性质分析
• 4.3.2 AMD中微生物群落功能基因多样性和结构概述
• 4.3.3 检测到功能基因分析
• 4.4 微生物群落功能基因组成和地化参量、空间距离之间的关系
• 4.5 讨论
• 4.6 小结
• 第五章 美国大平原高草牧场的土壤微生物群落在气候变化下演变的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 样地描述
• 5.2.2 土壤取样
• 5.2.3 磷酸酯脂肪酸分析
• 5.2.4 BIOLOG分析
• 5.2.5 实验室中土壤呼吸的测定
• 5.2.6 土壤有机活性碳和总有机碳的测定
• 5.2.7 微生物群落总DNA提取和纯化
• 5.2.8 GeoChip分析
• 5.2.9 数据统计分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 土壤温度、湿度和容重分析
• 5.3.2 土壤碳和氮分析
• 5.3.3 土壤呼吸作用、碳源利用、微生物生物量和相对丰度分析
• 5.3.4 功能基因多样性分析
• 5.3.5 微生物群落结构概述
• 5.3.6 功能基因的聚类分析
• 5.3.7 细菌、古菌和真菌的相对丰度
• 5.3.8 碳、氮、硫和磷循环过程相关功能基因的变化
• 5.3.9 微生物群落结构和环境变量之间的关系
• 5.4 讨论
• 5.4.1 微生物群落的适应性
• 5.4.2 加温处理的直接作用
• 5.4.3 其他因素
• 5.4.4 碳氮循环的生物学意义
• 5.5 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录1 用PicoGreen方法对双链DM进行定量的操作说明
• 致谢
• 主要研究成果