拟除虫菊酯类噬菌体抗体库的构建和筛选

论文摘要

拟除虫菊酯类农药的广泛使用导致了其在水体、茶叶、豆乳制品等多种经济作物中的残留,引起了人们的广泛重视,因此对拟除虫菊酯类农药的检测对于保障食品安全具有重要的意义。目前常用的仪器操作过程耗时、耗力,极大的影响了它们的实用性,导致市场监测滞后现象的发生。由于具有易操作,前处理过程简单,成本低,检测快速、准确、灵敏,可实现高通量、自动化检测等优点,免疫分析方法作为一种较为先进的小分子物质检测方法被广泛使用。在免疫分析中,抗体是决定这一方法灵敏度与特异性的关键因素。其中基因工程抗体是一种较为先进的抗体形式,具有分子量小、氨基酸组成清楚、便于基因改造、可大量制备、相对成本较低等优势,已经成为免疫分析方法的重点研究内容。本研究从实验室保存的特异性较高的拟除虫菊酯单抗细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得cDNA,利用兼并引物PCR扩增获得长度约为400bp的轻链可变区片段和重链可变区基因片段,重叠延伸PCR获得长度约为780bp的单链抗体基因片段。将该片段胶回收纯化后,使用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切,与T7噬菌体臂连接并包装后,成功构建拟除虫菊酯特异性的噬菌体抗体库。经测定,拟除虫菊酯原始噬菌体抗体库的滴度为2.67x105pfu,对噬菌体克隆随机PCR结果显示,抗体库的阳性率为81%。以人工合成的拟除虫菊酯-OVA为包被原对抗体库进行淘选,经过4轮淘选富集获得特异性的噬菌体克隆。随机选取4个阳性克隆进行序列测定,结果显示拟除虫菊酯类单链可变区基因中重链可变区由119个氨基酸构成、轻链可变区由108个氨基酸构成。本研究的开展,为拟除虫菊酯新型抗体的制备及其免疫检测方法的技术进步奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 拟除虫菊酯类农药（pyrethroid）残留检测
• 1.1.1 拟除虫菊酯类农药
• 1.1.2 拟除虫菊酯类农药残留的检测方法
• 1.2 基因工程抗体
• 1.2.1 天然抗体的分子结构
• 1.2.2 抗体的发展
• 1.2.3 基因工程抗体
• 1.2.4 基因工程抗体的分类
• 1.3 噬菌体展示技术
• 1.4 噬菌体抗体库
• 1.4.1 噬菌体抗体库的构建与筛选
• 1.4.2 噬菌体抗体库技术应用现状
• 1.5 本研究的目的和意义
• 1.6 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 动物材料
• 2.1.2 单克隆抗体细胞与菌种
• 2.1.3 生物试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.1.5 PCR扩增所用的引物
• 2.1.6 主要试剂的配置方法
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA提取
• 2.2.2 cDNA第一链的合成
• 2.2.3 单链抗体基因片段扩增
• 2.2.4 重叠延伸PCR
• 2.2.5 抗体库构建
• 2.2.6 抗体库淘选
• 2.2.7 淘选后噬菌体克隆测序
• 3 实验结果与分析
• 3.1 拟除虫菊酯单克隆抗体细胞总RNA的提取
• L基因和重链V_H基因片段的克隆'>3.2 拟除虫菊酯轻链V_L基因和重链V_H基因片段的克隆
• 3.3 拟除虫菊酯单抗细胞scFv片段的扩增
• 3.4 拟除虫菊酯单抗细胞scFv的双酶切
• 3.5 拟除虫菊酯噬菌体单链抗体库的构建
• 3.6 抗体库质量检测
• 3.7 拟除虫菊酯特异性重组抗体的淘选
• 3.8 噬菌体抗体库随机获得重组scFv基因PCR验证
• 3.9 单链抗体基因序列获得
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢