鸡胚成纤维细胞永生化的初步研究

论文摘要

成纤维细胞（fibroblast）由胚胎时期的间充质细胞（mesenchymal cell）分化而来,它是结缔组织（connective tissue）的主要细胞成分。由于相对容易获得,成纤维细胞已被广泛应用于分子和细胞生物学的研究的许多方面。鸡胚成纤维细胞（chickenembryo fibroblast）除了应用于细胞和分子生物学的研究,还被广泛应用于病毒学研究领域,同时也是疫苗生产的重要细胞资源。但鸡胚成纤维细胞和其他体外培养的正常的体细胞一样,生命周期是有限的。在体外培养一段时间后,细胞就会进入增殖抑制状态,即所谓的细胞衰老,最终发生死亡。本研究通过将猿猴病毒40大T抗原基因转染鸡胚成纤维细胞,以期获得能够长期体外培养的细胞。本研究采用酶消化法培养原代鸡胚成纤维细胞,利用脂质体介导的基因转染技术将含有猿猴病毒40大T抗原基因的载体转染原代培养的鸡胚成纤维细胞,再经嘌呤霉素抗性筛选,结果确定最终的抗生素筛选浓度为1.25μg/mL左右,筛选时间为10-12天左右。在此抗性筛选条件下,转染组细胞开始增殖,大约12天左右出现抗性细胞克隆;转染细胞呈现比较典型的梭形或星形细胞。当细胞长满后传代,一般每隔5-7天传代一次,一共传了15代,培养细胞的生长性能尚未发生明显的变化,细胞生长曲线表明,转染细胞增值周期具有典型的S特征,培养1-2天,细胞处于潜伏期,细胞数量缓慢增加,24-48小时后进入指数增长期;接种4-5天后,细胞数量达到高峰,此后,死亡细胞逐渐增多,细胞生长减缓;从转染细胞基因组模板中,扩增出产物为558bp的目的片段。与Hela细胞比较,转染细胞无致瘤性。通过多代次培养、转染细胞培养特性鉴定,说明本实验所获得的鸡胚成纤维细胞株已初步获得了长期传代的能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 绪言
• 1.1 细胞的衰老
• 1.1.1 复制性衰老
• 1.1.2 氧化压力
• 1.1.3 原癌基因激活
• 1.1.4 衰老的生理意义
• 1.1.5 细胞的危机期
• 1.1.6 永生化理论
• 1.2 研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 载体
• 2.1.4 主要试剂及配方
• 2.1.5 主要试剂的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2 细菌转化
• 2.2.3 质粒的抽提
• 2.2.4 原代鸡胚成纤维细胞的制备与传代
• 2.2.5 鸡胚成纤维细胞的转染,筛选与鉴定
• 3 结果
• 3.1 质粒的提取与电泳鉴定
• 3.2 鸡胚成纤维细胞的原代培养与传代
• 3.3 抗性细胞克隆的筛选与扩大培养
• 3.4 检测SV40LT基因DNA的整合
• 3.5 细胞的传代及生长曲线
• 3.6 细胞的形态观察
• 3.7 细胞的致瘤性检测
• 4 讨论与分析
• 4.1 质粒pCMVSV40T/PUR的导入与细胞永生化
• 4.2 细胞的培养环境对细胞的影响
• 4.2.1 温度对细胞的影响
• 4.2.2 pH值对细胞的影响
• 4.2.3 血清对细胞的影响
• 4.2.4 污染对细胞的影响
• 4.3 关于细胞的转染
• 4.4 关于细胞的生长曲线
• 4.5 关于细胞的形态
• 4.6 关于细胞的致瘤性检测
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢