鸭病毒性肠炎病毒gB基因主要抗原区域原核表达及其ELISA检测方法的建立

论文摘要

鸭病毒性肠炎（Duck virus enteritis,DVE）,俗称鸭瘟（Duck plague,DP）,是鸭、鹅、大雁等多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,由鸭病毒性肠炎病毒（Duckenteritis virus,DEV）引起。病毒基因组编码十几种糖蛋白,其中gB蛋白是病毒囊膜表面展示的主要蛋白之一,也是主要的免疫原蛋白。本试验使用鸡胚成纤维细胞培养鸭病毒性肠炎病毒,提纯病毒后提取病毒DNA作模板。根据GenBank获取DEV基因序列（登录号EF203709）,利用生物学软件DNAstar分析DEV gB蛋白氨基酸序列,筛选出其抗原性高、水溶性和表面展示概率高的2个区域(分别命名为gBaAsp113～Ala478;gBb Thr218～Val584),PCR扩增出这两段主要抗原区域并且克隆进入载体pMD18-T Vector,目的基因经PCR酶切鉴定后连接至原核表达载体pET-32a（+）。获得的重组质粒分别转化E coli BL21（DE3）感受态细胞,SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在IPTG诱导下以包涵体的形式高效表达,Western-blotting分析及重组蛋白免疫小鼠实验中血清抗体ELISA检测结果表明表达产物具有良好的抗原性,具有DEV诊断抗原及亚单位疫苗的应用前景。表达重组蛋白pET-32a-gBa经过初步纯化之后用作包被抗原,建立了针对DEV血清抗体的间接ELISA检测方法。并且确定了最适抗原包被浓度为2.5μg/mL、最适血清稀释度为1:800、血清最适作用时间90min、最佳封闭条件为0.15%的BSA 4℃封闭24h、酶标抗体最适稀释度为1:1000,最适作用时间为30min,底物最适显色时间为37℃5min,判定标准为OD450≥0.446为阳性。应用该间接ELISA方法检测了实验室保存的DEV阳性血清。结果表明该诊断方法具有良好的特异性及敏感性,显示了良好的应用前景。本研究成功克隆表达了DEV gB基因的主要抗原区域,获得了可溶性表达的目的蛋白,为研究gB基因的功能奠定了良好的基础。利用表达的重组蛋白pET-32a-gBa成功建立了快速简便的ELISA诊断方法,为开发DEV商品化试剂盒,进行DEV流行病学调查及对其控制消灭提供了一定的技术支撑。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 鸭病毒性肠炎研究进展
• 2 鸭病毒性肠炎病毒囊膜糖蛋白gB研究进展
• 3 实验研究目的和意义
• 4 研究内容和方法
• 参考文献
• 研究内容
• 第二章 鸭病毒性肠炎gB基因主要抗原区域原核表达及其产物的抗原性分析
• 摘要
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第三章 鸭病毒性肠炎病毒重组抗原间接ELISA诊断方法的建立
• 摘要
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 附录
• 致谢