阿霉素纳米制剂克服肿瘤多药耐药作用的研究

论文摘要

肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生多药耐药性（multidrug resistance,MDR）是导致肿瘤化疗失败的重要原因,也是化疗介入肿瘤治疗以来一直悬而未决的重要问题。克服MDR的策略主要包括化疗增敏剂如维拉帕米等的开发,肿瘤药物进行结构改造,生物技术相关的逆转方法如基因治疗等,这些策略均存在一定不足。药物载体作为一种新型的MDR逆转策略,既可提高化疗药物作用的敏感性,又可不增加化疗药物对正常组织的毒副作用,还可突破抗肿瘤药物的剂量限制,可有效克服上述克服MDR策略的不足而受到较大关注。本论文分别制备了阿霉素（doxorubicin,DOX）脂质体、阿霉素固体脂质纳米粒、阿霉素非离子型表面活性剂囊泡等三种纳米制剂,并分别用非离子型表面活性剂、阳离子材料等修饰脂质体、固体脂质纳米粒,同时将脂质体和维拉帕米联合应用,对阿霉素的细胞积聚及其胞内动力学特征,细胞摄取、外排机制和克服肿瘤细胞多药耐药作用的可能机制进行了探讨,同时研究了Pluronic P85修饰阿霉素脂质体的小鼠药代药动学和药效学以及阿霉素非离子型表面活性剂囊泡的小鼠药效学。论文首先建立了耐药细胞模型和分析测定方法。结果显示K562/DOX细胞P-gp高表达,对阿霉素耐药指数达107.50,而维拉帕米（Ver）可部分逆转耐药性。K562/DOX细胞可以作为以阿霉素为模型药的纳米制剂克服肿瘤细胞耐药作用及机理研究的细胞模型。以荧光分光光度计法测定DOX的浓度,DOX浓度在10～1000ng/mL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9998;该方法日内、日间精密度、回收率符合测定要求。并通过在测定过程添加0.1%十二烷基硫酸钠孵育30min,有效地解决了阿霉素测定过程的荧光淬灭。脂质体可部分克服肿瘤多药耐药作用。首先采用硫酸铵梯度法制备了阿霉素脂质体,药物稳定,渗漏少。K562/DOX细胞摄取结果显示,阿霉素脂质体（DOX-L）较同浓度的溶液（DOX-I）有更多被耐药细胞摄取。而耐药细胞外排阿霉素脂质体较溶液缓慢,说明阿霉素脂质体具有延缓药物外排的作用。药物敏感试验（MTT）检测脂质体的耐药指数降低为3.30,说明阿霉素脂质体可部分克服多药耐药。低温和内吞抑制剂（叠氮钠、甘露醇和氯喹）均显著降低K562/DOX细胞内DOX的积聚,说明耐药细胞摄取脂质体是通过能量依赖性的内吞方式。为了进一步了解DOX的细胞动力学及其DOX在亚细胞器的分布,我们采用HPLC建立了细胞内亚细胞器（细胞核）的含量测定方法。DOX-L和DOX-I在亚细胞器的分布结果显示,与对照DOX-I相比,相同药物量的DOX-L与细胞孵育后,能显著提高细胞核内药物量。而且脂质体减慢消除速率,延长细胞内药物滞留时间,改变药物在细胞内的动力学特征和分布,提高了细胞核内药物量;说明阿霉素脂质体有趋核分布的特点。非离子型表面活性剂修饰脂质体后,将对细胞摄取、外排行为和克服多药耐药产生影响。采用非离子型表面活性剂pluronic、Span、Tween和Cremophor EL修饰脂质体,包封率均达到90%以上,粒径与阿霉素脂质体相似。脂质体渗漏结果显示,随着非离子型表面活性剂HLB值的降低,渗漏加快。对于同系列的非离子型表面活性剂,2h时K562/DOX摄取药物量随非离子型表面活性剂的HLB值降低,摄取增加。但对不同系列的表面活性剂修饰的脂质体,摄取量除与HLB值相关外,还可能与表面活性剂的性质相关。MTT检测结果显示修饰后的细胞毒作用增加,随HLB值降低,细胞毒作用增加,证实了非离子型表面活性剂修饰的阿霉素脂质体可更有效克服多药耐药。阳离子脂质体可促进阿霉素趋核,但可能降低耐药细胞摄取药物量。采用DC-Chol和CTAB制备了阳离子脂质体,发现进入细胞的药物量较普通脂质体有所下降,但细胞核的药物量却和脂质体相当,细胞核百分比高于普通脂质体。维拉帕米核阿霉素脂质体具有协同抗多药耐药作用。为了评价维拉帕米对阿霉素脂质体摄取和外排行为的影响,试制了5种阿霉素制剂,结果发现DOX脂质体与维拉帕米溶液混合液（DOX-L-FV）摄取速率快,2h摄取药物量最大。而阿霉素和维拉帕米共同包被脂质体（DOX-L-LV）摄取速率相对慢,但达稳态的时间延长,在4h摄取药物量接近DOX-L-FV。由于DOX-L-LV可降低阿霉素和维拉帕米的心脏毒性,有望被开发为新剂型。细胞内药物外排结果显示含维拉帕米组明显减缓了外排速率。MTT检测结果显示:DOX-L-LV＜DOX-L-FV＜DOX-I-FV＜DOX-L＜DOX-I,显示脂质体和维拉帕米有良好的协同作用。采用S180肿瘤模型评价了Pluronic P85修饰的脂质体（DOX-L-Pluronic P85）在小鼠的药代动力学和药效学。首先建立了小鼠血浆和组织样品中DOX含量测定的HPLC方法。体内药动学研究结果显示,DOX-L-Pluronic P85可显著延长DOX的体内循环时间,提高血浆中药物浓度,其消除半衰期为DOX-I的6.72倍,AUC为DOX-I的6.21倍。DOX-L-Pluronic P85可增加DOX在肿瘤内的分布,其AUC和峰浓度分别为DOX-I组的4.65和1.44倍。其各器官（包括心、肾、肝、脾、肺、肠）的相对靶向效率均大于1,心、肾的相对靶向效率更是10倍以上,说明DOX-L-Pluronic P85的小鼠心、肾毒性显著低于DOX-I组（p＜0.01）。DOX-L-Pluronic P85 2mg/kg时其抑瘤率为30.83%,与同剂量的DOX-I抑瘤率相当（32.09%）;1mg/Kg和4mg/kg的DOX-L-Pluronic P85的抑瘤率分别为28.53%和51.91%,显示较好的剂量依赖性。DOX-I用药后体重较对照组有所降低,而采用DOX-L-PLURONIC P85治疗,体重较对照组增加,显示了DOX-L-Pluronic P85毒性低.肿瘤病理切片显示,DOX-L-PLURONIC P85对肿瘤细胞抑制作用显著,对心肌毒性小。固体脂质纳米粒（SLN）也可有效克服肿瘤多药耐药。通过阴离子聚合物络合法有效地解决了水溶性细胞毒药物阿霉素的固体脂质纳米粒包封率。与阿霉素溶液相比,固体脂质纳米粒可以显著提高细胞对药物的摄取,说明固体脂质纳米粒具有克服肿瘤细胞耐药性的作用,而外排试验说明固体脂质纳米粒可以延缓药物细胞内消除。我们分别采用Pluronic F87、F88和P85三种不同Pluronic制备了DOX-SLN,其粒径和包封率相似,但细胞摄取试验显示DOX-SLN-P85在各时间点进入细胞的量比DOX-SLN-F87和DOX-SLN-F88多。这可能由于Pluronic组成不同,导致耐药细胞K562/DOX的细胞膜的流动性不同,从而影响SLN进入细胞的量。另外制备了CTAB修饰的DOX-SLN,发现阳离子CTAB修饰的SLN具有细胞核靶向性。MTT实验证实了DOX-SLN可部分克服多药耐药,低温和内吞抑制试验说明细胞摄取DOX-SLN为通过能量依赖的内吞途径。非离子型表面活性剂囊泡具有克服部分肿瘤多药耐药的作用。采用薄膜分散法制备了DOX非离子型表面活性剂囊泡（DOX-N）。DOX-N和耐药细胞K562/DOX孵育后摄取进入细胞的量显著高于阿霉素溶液,4h进入细胞的药物为阿霉素溶液的1.4倍。内吞抑制剂和低温摄取实验显示K562/DOX细胞摄取非离子型表面活性剂囊泡也主要通过内吞途径。MTT实验提示DOX-N可部分克服多药耐药的机制可能抑制P-gp表达采用K562/DOX细胞嫁接法建立了动物耐药模型,随时间的延长,DOX-N组与DOX-I组的肿瘤体积相比明显减小,差异有显著性。DOX-N组的抑瘤率高达为67.97%,远高于DOX-I组（16.12%）。体外细胞和在体实验说明,DOX-N有效克服了多药耐药。本论文的研究,将为这些制剂克服肿瘤多药耐药作用的进一步研究提供理论参考和实验依据。细胞药动学和亚细胞器的分布研究将为纳米载体的设计提供新的手段。非离子型表面活性剂在克服多药耐药上的研究,将促进对耐药机制的理解。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 缩写、术语表
• 目次
• 引言
• 第一部分 阿霉素脂质体克服多药耐药的研究
• 第一章 K562/DOX耐药细胞的评价及阿霉素测定方法的建立
• 第二章 阿霉素脂质体的制备及其克服多药耐药的研究
• 第三章 阿霉素脂质体的胞内动力学模型的建立
• 第二部分 脂质体表面修饰对克服多药耐药的影响
• 第一章 非离子型表面活性剂修饰脂质体对克服多药耐药的影响
• 第二章 阳离子脂质体对胞内动力学的影响
• 第三章 脂质体和维拉帕米联合应用对K562/DOX细胞积聚的影响
• 第三部分 Pluronic P85修饰的阿霉素脂质体的药动学和药效学研究
• 1 材料与方法
• 2 实验方法
• 3 结果与讨论
• 4 小结
• 第四部分 阿霉素固体脂质纳米粒的制备及其克服多药耐药的研究
• 1 材料与仪器
• 2 方法
• 3 结果与讨论
• 4 小结
• 第五部分 非离子型表面活性剂囊泡克服多药耐药的研究
• 1 材料与仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果和讨论
• 4 本章研究小结
• 全文总结
• 论文创新点
• 参考文献
• 综述
• 作者简历