凋亡抑制基因XIAP在食管癌中的表达及RNAi下调其在食管癌中表达对化疗敏感性影响的研究

论文摘要

目的食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一,发病率较高,在地区间差别较大。它的特征是早期诊断比较困难且预后差,我国食管癌的发病率目前居世界第一位,发病人数占发病总数的60%,且男性的发病率是女性的2倍。全世界每年新发食管癌病例约30万。我国食管癌发病率为13/10万,但是食管癌的确切发病机制尚不明确,且对于食管癌的治疗主要是手术治疗为主联合放疗和化疗的综合治疗,但是现有方法已经达到其治疗的极限,只有深入研究其发病机制,并寻找新的治疗方式才能提高食管癌的治愈率。现有的研究发现,肿瘤的发生与其凋亡率降低有关,最重要的凋亡通路就是Caspase通路。X染色体连锁的凋亡抑制基因（X-linkedinhibitor of apoptosis protein,XIAP）是凋亡抑制基因家族中重要的成员之一,其编码的蛋白XIAP通过选择性的抑制Caspase-3,-7和-9,并参与其它途径来抑制细胞的凋亡,XIAP是该基因家族中唯一能够同时抑制起始和效应阶段的IAP。本研究拟在探索XIAP与食管癌之间的关系,从三个方面探讨XIAP与食管癌的发生发展以及对食管癌化疗敏感性的影响。第一,通过免疫组化、RT-PCR和Western Blot检测XIAP在食管鳞癌和正常食管组织中的表达,并检测其在多株食管鳞癌细胞系中的表达情况;第二,通过化学合成法合成的XIAP特异的siRNA,观察能否通过RNAi方法降低XIAP在食管癌细胞中的表达;第三,若能通过RNAi方法降低食管癌细胞中XIAP的表达,探讨XIAP低表达对食管癌细胞凋亡的影响,更重要的是观察其对多种化疗药物敏感性影响。材料与方法1、临床标本及组织芯片制作:食管鳞癌及癌旁正常食管配对组织取自安徽医科大学胸外科,由2位以上资深病理学家诊断为食管鳞癌,所有病人术前均未经放化疗。新鲜组织采用手术分离,并在术后立即置于液氮中冻存,选取110对食管癌配对组织常规石蜡包埋。组织芯片在Beecher组织芯片仪制作完成,在蜡块上设计14×7共98点组织阵列,打孔并将供体蜡块标记部位取出的组织柱推入预先设计的相应孔内;对蜡块进行连续切片,裱于防脱片载玻片上。2、食管鳞癌细胞培养:本研究中选用的人食管鳞癌细胞系,其中TE10、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE450、KYSE510细胞系由日本Kyoto University的Shimada Y博士惠赠,EC9706由王明荣教授惠赠。食管癌细胞被培养在RPMI1640培养基中,这个培养基含有10%胎牛血清,不含有抗生素,生长环境是5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养。3、siRNA合成及细胞转染:XIAP-siRNA由Invitrogen公司设计合成,并在Hela细胞中验证其对XIAP的抑制效率。我们采用脂质体法,应用Lipofectamine2000转染试剂进行转染,siRNA转染浓度为25nm。4、RT-PCR半定量法检测XIAP在组织标本和细胞中的表达:食管癌组织、癌旁正常食管组织和食管癌细胞均按Trizol法提取总RNA,然后进行RT-PCR,最终的结果应用Gel-pro Analyzer软件进行半定量分析。5、Western Blot半定量法检测XIAP在组织标本和细胞中的表达:食管癌组织、癌旁正常食管组织和食管癌细胞按照常规方法提取胞浆总蛋白,进行蛋白定量后,进行Western Blot,最终的结果应用Gel-pro Analyzer软件进行半定量分析。6、免疫组织化学染色及结果分析:采用微波法修复抗原,应用ABC免疫组化试剂盒按照ABC法进行免疫组化染色,免疫组化染色结果采用二级记分法进行判定,结果判定由两位病理科医生分别独立完成,取二者平均值作为最终结果。7、流式细胞术检测细胞凋亡:同时收集悬浮和贴壁生长的细胞,PI法染色,应用FACSCalibur flow cytometer流式细胞仪检测,CellQuest软件进行结果分析,sub-G1-G0区细胞被认定为凋亡细胞。8、化疗药物处理及MTT法检测细胞活性:按照实验设计对接种于96孔板的细胞进行siRNA转染,并加入相应浓度的化疗药物,在设定的时间点应用MTT法检测细胞活性。9、应用SPSS11.0软件进行统计分析,XIAP在食管癌和正常组织表达的差异应用非配对T检验进行,XIAP的表达与临床病理因素之间的关系用卡方检验和Sperman’s相关分析进行分析。IC50的计算采用Probit分析法计算,不同组之间的均数比较采用Student-Neuman-Keuls多样本均数检验进行分析。P＜0.05认为有统计学意义。结果1、首先我们通过免疫组织化学、RT-PCR和Western Blot的方法检测XIAPmRNA和XIAP蛋白在食管鳞癌组织、癌旁正常食管组织和食管鳞癌细胞系中的表达,不同的方法检测的结果一致显示其在食管癌组织中的表达显著高于其在正常食管组织中的表达（统计分析均显示P＜0.01）,同样其在大多数食管癌细胞系中高表达,但是其在食管癌组织中的表达与食管癌患者的临床病理因素如:患者的年龄、性别、食管癌的分化程度和TNM分期无统计学相关。2、我们选择了两株XIAP高表达细胞系KYSE150、EC9706和两株XIAP低表达细胞系TE10、KYSE510,进行XIAP-siRNA转染,选取转染后24小时、48小时和72小时三个时间点,通过RT-PCR和Western Blot检测发现,XIAP-siRNA在mRNA和蛋白水平均能够有效地降低XIAP的表达,对XIAP的抑制率可以达到90%以上。3、应用XIAP-siRNA进行RNA干扰后食管癌细胞XIAP低表达,我们检测了其对细胞凋亡的影响,结果显示在XIAP高表达细胞系,XIAP的表达降低能够显著增加细胞的凋亡,而在XIAP低表达细胞系中XIAP的低表达对细胞的凋亡率没有影响（P＜0.01）,这两方面结果提示食管癌细胞凋亡的增加确实是由XIAP的表达降低引起的。4、在研究XAIP低表达后对食管癌细胞化疗敏感性的影响中,结果发现,在XIAP高表达细胞系KYSE150、EC9706中,降低XIAP的表达能够显著增加所有细胞对所有化疗药物紫杉醇（PTX）、顺铂（DDP）、依托泊苷（VP-16）和氟尿嘧啶（5-Fu）的敏感性;而对于XIAP低表达系,在TE10仅能增加对四种中的三种化疗药物紫杉醇（PTX）、顺铂（DDP）和依托泊苷（VP-16）的敏感性,在KYSE150中仅能增强对紫杉醇（PTX）敏感性,且这两株细胞中,XIAP低表达对化疗药物敏感性的增加远不如在XIAP高表达细胞系中显著。结论1、X染色体连锁的凋亡抑制基因XIAP在食管鳞癌组织中明显高于其在正常食管组织中的表达,但是与患者的临床病理因素（年龄、性别、食管癌的分化程度和TNM分期）无关,基于此,可为食管鳞癌的病理诊断提供了一个新的免疫组织化学指标,可能会对食管癌的诊断提供一定的辅助作用。2、XIAP特异的siRNA能够显著降低食管癌细胞中XIAP的表达,在降低XIAP后,能够显著增加XIAP高表达食管癌细胞的细胞凋亡,进一步验证了XIAP主要通过Csapase凋亡通路在食管癌生长中的抑制凋亡和促进生长的作用。3、通过RNAi降低XIAP表达后,能够显著增强XIAP高表达细胞系对紫杉醇（PTX）、顺铂（DDP）、依托泊苷（VP-16）和氟尿嘧啶（5-Fu）的敏感性,结合在降低XIAP后,能够显著增加XIAP高表达食管癌细胞的细胞凋亡,本研究为增加食管癌化疗敏感性提供了基础研究方面的依据,有可能为食管癌的临床治疗带来新的突破。

论文目录

• 一、摘要
• 中文论著摘要
• 英文论著摘要
• 二、英文缩略语
• 三、论文 凋亡抑制基因XIAP在食管癌中的表达及RNAi下调其在食管癌中表达对化疗敏感性影响的研究
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 四、本研究创新的自我评价
• 五、参考文献
• 六、附录
• 综述
• 在学期间科研成绩
• 致谢
• 个人简介