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RhoA在肝前体细胞体外分化中的作用研究

2020-11-29阅读(641)

RhoA在肝前体细胞体外分化中的作用研究

论文摘要

肝卵圆细胞是目前公认的肝干/祖细胞之一,具有在体外分化成成熟的肝细胞和胆管细胞的能力。WB-F344细胞是从Fischer雄性大鼠肝脏分离出来的卵圆细胞,常被作为进行体外研究肝干/祖细胞向成熟肝细胞或者胆管细胞分化的模型。Matrigel是一种从小鼠肉瘤中抽提得到的人工合成的可溶性间质膜蛋白复合物,它能够模拟体内间质微环境,促进各种管状结构的形成。有研究发现当WB-F344细胞接种于Matrigel上之后,细胞能够被诱导分化成为胆管细胞,细胞开始收缩形成管腔样结构并沿着结构拉伸。与此同时发现胆管系基因如Yp、Aquaporin、CK19等特异性表达。表皮形态发生素epimorphin（EPM）是一个高度保守的间质细胞表面膜蛋白,在哺乳动物中广泛表达,在腺管状结构的形态发生过程中发挥了重要的作用。我们的研究发现EPM也能诱导WB-F344细胞向胆管细胞分化并且对WB-F344细胞内的应力纤维的排列有很大影响。在Matrigel和EPM诱导的WB-F344细胞向胆管细胞分化的过程中RhoA的表达活性均发生上调。小G蛋白RhoA是位于细胞内的重要细胞骨架调节蛋白,参与控制细胞的变形、运动、粘附及细胞的分裂、恶性肿瘤细胞的浸润、转移等。我们初步的研究结果也表明RhoA在Matrigel以及EPM诱导的WB-F344细胞分化过程中发挥了重要的作用。本课题主要研究细胞外基质Matrigel、细胞外因子EPM以及细胞内信号分子RhoA如何有机结合诱导肝卵圆细胞WB-F344细胞向胆管细胞分化。我们首先成功建立Matrigel诱导WB-F344细胞向胆管细胞分化的模型,观察WB-F344细胞在诱导分化过程中的形态变化、胆管细胞相关基因表达变化情况以及RhoA的表达变化情况。与此同时建立EPM-PT67、WB-F344细胞共培养模型,利用脂质体转染法将EPM质粒转染进PT67细胞中并通过极限稀释法筛选出稳定表达EPM的PT67细胞。通过丝裂霉素处理EPM-PT67细胞和PT67细胞使其停止生长并将其作为滋养层细胞后,接种WB细胞进行共培养,观察WB细胞的形态学变化、胆管系基因和蛋白的表达变化情况以及RhoA的表达情况。在上述工作的基础上,利用pfu点突变技术构建了RhoA基因的始终活性突变体CA（Constitutively Active）和始终失活突变体DN（Dominant Negative）,经测序鉴定正确。之后将基因突变体进行慢病毒包装,稳定转染进WB-F344细胞中,同时利用空慢病毒载体转染进细胞做对照,观察RhoA CA WB细胞、RhoA DN WB细胞、对照细胞的形态学变化以及胆管系基因的表达变化情况。电镜观察WB-F344细胞的超微结构,寻找胆管细胞、肝细胞的特征性超微结构,进一步判断RhoA突变后细胞的分化趋势。最后进行RhoA信号通路的探索和定位,通过加入RhoA下游信号分子ROCK的抑制剂Y27632观察细胞形态的变化等来确定ROCK在该过程中的作用,同时还观察细胞内应力纤维束的排列,进一步明确RhoA-ROCK的作用;与此同时提取RhoA CA、RhoA DN、对照三种WB细胞的蛋白,利用蛋白电泳技术观察EPM信号通路上的FAK、ERK等信号分子的变化情况,确定RhoA在EPM信号作用通路中的位置。研究结果显示在Matrigel培养以及EPM-PT67共培养体系中的WB-F344细胞,细胞形态均发生明显的改变,细胞均收缩并形成管腔样结构,RT-PCR结果显示胆管系基因如Yp、Aquaporin、CK19和CX43等的表达量均明显上调,而且RT-PCR以及免疫荧光的结果也显示在WB-F344细胞的胆管分化过程中RhoA的表达量均上调,说明这两种体外诱导模型均能成功的诱导肝卵圆细胞向胆管细胞分化。我们利用点突变技术成功地构建了RhoA基因CA和DN两种突变体并利用慢病毒载体将这两种突变体高效转染进WB-F344细胞中。尽管RhoA基因突变并没有影响WB-F344细胞的细胞周期以及细胞的生长,但是细胞的形态却发生了明显地变化:转染RhoA DN的WB细胞体积变大,分支增多,核质比下降,细胞间隙模糊;而RhoA CA WB细胞则收缩呈圆形,细胞的核质比变大,细胞与细胞间有明显的间隙。透射电镜检测显示转染RhoA CA的WB细胞具有胆管细胞的特异性结构:卵圆形的细胞核、核仁弥散、胞浆少、细胞器较少、线粒体形态较小、细胞间紧密连接较多以及桥粒增多等;而对照细胞则显示了成熟肝细胞的超微结构特征:圆形的细胞核、核仁明显、胞浆丰富、细胞器较多、糖原颗粒丰富、较多的粗面内质网、线粒体形态偏大以及细胞间无紧密连接等。以上的结果说明RhoA基因的突变能引发肝卵圆细胞的形态学变化并影响其分化决定。我们随后将CA、DN、con三种WB细胞接种于Matrigel上或者与EPM-PT67细胞共培养,发现即使在没有Matrigel/EPM作用的情况下RhoA CA WB细胞也能自发地形成管腔样结构,并且细胞内各胆管系基因的表达量明显上调;EPM无法诱导RhoA DN WB细胞形成管腔样结构,这些结果说明RhoA在Matrigel和EPM的诱导分化过程中是不可或缺的。在EPM、RhoA的下游信号分子研究中,Y27632抑制RhoA CA以及EPM诱导的WB细胞管腔样结构的形成;共聚焦显微镜下观察到RhoA CA WB细胞内应力纤维束较多,并且应力纤维束沿着细胞拉伸的方向排列,而对照细胞内的应力纤维束较少并且呈分散状分布细胞的边缘;另一方面虽然三种细胞内总ERK蛋白的表达量是一致的,但是RhoA CA WB细胞内磷酸化FAK、ERK1/2蛋白的表达量相对于con和RhoA DN WB细胞明显上调。由以上结果得知EPM和RhoA诱导分化的作用信号通路是EPM→αⅴβ1 integrin→RhoA→FAK→ERK1/2→MMP3/CEBPβ→Differetiation以及EPM→αⅴβ1 integrin→RhoA→ROCK→Stress Fibre Formation→Morphogenesis。综上所述,我们首先成功构建Matrigel培养和EPM-PT67共培养两种体外诱导分化体系,形态结构观察以及分子水平鉴定都证明WB-F344细胞在这两种体系下能向胆管细胞分化;其次证明RhoA是Matrigel/EPM诱导的胆管细胞分化过程中不可或缺的重要作用因子,RhoA的缺乏会导致EPM无法诱导WB-F344细胞向胆管细胞分化;最后根据信号分子表达变化情况提出EPM、RhoA作用的信号通路。我们的研究为体外进行胆管细胞定向诱导分化提供良好的生物学模型,将细胞外基质、胞外因子与胞内信号分子联系起来,对肝前体细胞分化的机制研究具有指导作用,具有广阔的临床应用前景。

论文目录

  • 缩略语表
  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 前言
  • 第一部分、肝前体细胞WB-F344 细胞体外诱导分化模型的建立
  • 前言
  • 实验一、Matrigel-WB-F344 培养模型的建立以及相关分化指标的检测
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 实验二、EPM 表达质粒的鉴定及稳定表达的PT67 细胞的筛选
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 实验三、EPM-PT67 细胞与WB-F344 细胞的共培养
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 第二部分、RhoA 突变体的构建、慢病毒的包装以及WB-F344 细胞的转染
  • 前言
  • 实验一、RhoA 基因的提取及测序
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 实验二、RhoA 基因的点突变
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 实验三、RhoA 突变基因的慢病毒包装
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 实验四、转染RhoA 突变基因WB-F344 细胞的RhoA 检测
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 第三部分、RhoA 基因突变对WB 细胞的作用研究
  • 前言
  • 实验一、转染RhoA 突变基因WB-F344 细胞的形态学观察
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 实验二、转染RhoA 突变基因WB-F344 细胞的细胞周期检测以及生长情况测试
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 实验三、转染RhoA 突变基因WB-F344 分化指标的检测
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 第四部分、RhoA 在WB-F344 发育分化过程中的信号通路初探
  • 前言
  • 实验一、Y27632 对WB 细胞的抑制作用以及RhoA 对应力纤维束分布、排列的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 实验二、信号分子FAK、ERK1/2 及其磷酸化状态的检测
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 讨论
  • 参考文献
  • 总结
  • 附录一、设备与材料
  • 附录二、在学期间发表论著，参编专著及申报专利
  • 个人简历
  • 致谢

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