论文摘要
目的:研究巨噬细胞移动抑制因子(MIF)在体外对人结肠癌细胞HT-29增殖及VEGF和IL-8表达的影响,并进一步探讨MIF通过PI3K/Akt通路调控结肠癌细胞生长及血管生成因子表达的信号转导机制。方法:HT-29细胞饥饿24h达同步化后,实验分成对照组、不同浓度的人重组MIF(rhMIF 25、50、100μg/L)组和50μg/L rhMIF联合LY294002预处理组,分别作用于HT-29细胞不同时间,应用:(1)MTT(四甲基偶氮唑蓝比色法)法分别于0、12、24、48h检测rhMIF对HT-29细胞生长增殖的影响及LY294002预处理组细胞增殖状态。(2)RT-PCR法检测不同浓度rhMIF对HT-29细胞作用0、12、24、48h后及LY294002预处组24h VEGF、IL-8 mRNA的表达。(3)ELISA法分别于0、12、24、48h检测rhMIF组细胞培养上清液中VEGF和IL-8蛋白水平及LY294002预处理组24h上清液中VEGF、IL-8蛋白水平。(4)Western-blot法检测rhMIF作用于HT-29细胞0、15、30、60min时Akt蛋白的磷酸化水平及LY294002预处理组30min时p-Akt水平。结果:(1)不同浓度rhMIF作用12,24,48h后,能够促进HT-29细胞生长,增殖活性随浓度增加、时间延长逐渐上升(P<0.05),呈现量-效、时-效关系;LY294002预处理组对HT-29细胞的生长具有抑制作用,与rhMIF组比较差异有显著性意义(P<0.01),而与对照组相比未见明显变化(P>0.05)。(2)不同浓度rhMIF处理HT-29细胞24h,50μg/L rhMIF作用12,24,48h,VEGF、IL-8 mRNA表达均明显高于对照组,存在时间和浓度依赖性(P<0.05),而LY294002预处理能明显下调VEGF、IL-8 mRNA的表达(P<0.01)。(3)正常对照组HT-29细胞培养上清液中VEGF、IL-8蛋白含量低, rhMIF处理细胞12h,24h,48h显著诱导VEGF、IL-8蛋白分泌,存在时间和浓度依赖性(P<0.05);上清中VEGF最高含量为对照组的6倍,IL-8最高含量为对照组的30倍。LY294002对rhMIF诱导的VEGF和IL-8蛋白分泌均产生抑制(P<0.01),与对照组相比无明显变化(P>0.05)。(4)Western-blot结果显示:50μg/L rhMIF作用于HT-29细胞0、15min、30min、60min,与对照组相比,p-Akt蛋白表达在30min时达高峰。25、50、100μg/L rhMIF作用于HT-29细胞30min,与对照组比较,p-Akt表达明显增加(P <0.01);rhMIF浓度越高,p-Akt蛋白水平上升趋势越明显,呈剂量依赖性。PI3K抑制剂LY294002预处理后再施加rhMIF,磷酸化Akt蛋白水平明显降低,与rhMIF组相比差异有显著性意义(P<0.05)。结论:(1)MIF能够促进结肠癌细胞生长和增殖,MIF参与结肠癌血管形成可能是通过上调促血管生成因子VEGF和IL-8的表达发挥作用。(2)MIF诱导人结肠癌细胞增殖和血管生成因子表达可能部分是通过活化PI3K/Akt信号转导通路实现的。
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