白菜脱水应答转录因子BpDREB基因的克隆与转化

论文摘要

研究发现植物的抗逆性与编码抗逆相关蛋白的结构基因和信号传递、调控结构基因表达的转录因子（如bZIP转录因子、MYC转录因子、DREB转录因子等）的表达与调控有关。多年来,对第一类基因的研究,即结构基因的表达特性、结构与功能的研究,取得了很大的成就。但对植物细胞在受到胁迫后,如何将这些信号传递以及对下游基因的表达及调控等一系列分子机理了解甚少,因此,对转录因子的克隆、表达特性及调控作用的研究成为当今植物抗逆分子生物学研究领域热点之一。植物中存在着许多与胁迫相关的转录因子,其中脱水应答元件（Dehydrationresponsive element binding,DREB）在干早、高盐,及低温胁迫信号传递过程中起重要作用,该类转录因子特异存在于植物中,属于AP2/EREBP家族。该类转录因子均含有AP2/EREBP DNA结合域,具有与DRE顺式作用元件结合的特异性。DRE顺式作用元件的核心序列为CCGAC。研究表明在许多植物的抗逆结构基因中都有DRE元件的核心序列。DREB的过表达可以同时调控一系列抗逆基因的表达,从而提高植物细胞整体抗逆特性。因此,从克隆转录因子基因入手,进而进行转基因植物研究是提高作物抗逆性质更为有效的方法和途径。本实验首先通过GenBank、DDBJ等网上数据库信息资源,对已登陆的DREB相关信息进行查阅、归纳、总结分析及序列比对,设计特异引物,利用同源克隆的方法,在具有良好抗寒性的白菜秋绿60的DNA中克隆了一个DREB基因,该基因全长777bp,具有一个长771bp的开放阅读框,编码一个256个氨基酸的多肽,含有一个保守的AP2/EREBP DNA结构域,具有DREB亚家族成员保守的V14和E19两个氨基酸,命名为BpDREB（Brassica rapa subsp.Pekinensis DREB）。之后,利用同样的引物在低温诱导的白菜幼苗叶片总体RNA逆转录的cDNA中,也扩增到了相同分子量的基因,测序发现其与DNA中序列相同,证明该基因可能是一个具有功能的基因。为了验证BpDREB的功能,本研究将BpDREB构建到表达载体pCAMBIA1301中,获得重组质粒pCAMBIA1301-BpDREB。用冻融法转化农杆菌感受态细胞,选取阳性克隆菌,液体培养至对数期,用花序导入法转化拟南芥。收集转化过的拟南芥种子,经过低温打破休眠后,种植在含有卡那霉素的培养基中,大多数种子及幼苗筛选过程中死去,少数生长良好的幼苗可能是转化了外源基因的植株,移栽到培养土中继续培养,待进一步的转基因分子鉴定及抗性鉴定。该研究植物抗逆调控基因的功能研究提供了可靠的依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 与植物抗逆相关的蛋白质
• 1.1.1 水通道蛋白
• 1.1.2 LEA蛋白
• 1.1.3 转录因子
• 1.2 植物抗逆信号的转导及其表达调控
• 1.3 转录因子与植物抗逆应答途径
• 1.3.1 依赖于ABA的表达调节途径
• 1.3.2 不依赖于ABA的表达调节途径
• 1.4 植物中的DREB类转录因子
• 1.4.1 DRE元件
• 1.4.2 转录因子的结构特征
• 1.4.3 DREB类转录因子的表达及对胁迫反应的调节
• 1.5 DREB转录因子上游的调控因子
• 1.6 本论文的选题意义
• 1.7 技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂及试剂盒
• 2.1.3 载体和菌株
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 BPDREB基因的获得及克隆
• 2.2.1.1 白菜秋绿60基因组DNA的提取
• 2.2.1.2 白菜秋绿60 BPDREB基因的PCR扩增
• 2.2.1.2.1 特异引物的设计
• 2.2.1.2.2 PCR扩增反应
• 2.2.1.3 目的基因BPDREB PCR产物纯化回收
• 2.2.1.4 目的片段的克隆
• 2.2.1.4.1 扩增片段3端加“A”尾
• 2.2.1.4.2 目的片段与克隆载体的连接反应
• 2.2.1.4.3 大肠杆菌感受态的制备及转化
• 2.2.1.4.4 重组子的筛选及鉴定
• 2.2.1.4.4.1 PCR法利用通用引物筛选重组子
• 2.2.1.4.4.2 PCR法利用特异引物筛选重组子
• 2.2.1.4.4.3 大肠杆菌质粒DNA的小量制备及酶切鉴定
• 2.2.1.5 测序及序列分析
• 2.2.2 基因表达的验证
• 2.2.2.1 白菜中总RNA的提取及反转录
• 2.2.2.3 目的片段的扩增
• 2.2.2.4 目的片段的克隆及测序
• 2.2.3 BPDREB基因表达载体的构建
• 2.2.3.1 质粒的提取
• 2.2.3.2 植物表达载体PCAMBIA1031的酶切与大片段的回收、纯化
• 2.2.3.3 构建带有BglⅡ和BstEⅡ接头的BPDREB基因
• 2.2.3.4 接头目的片段的克隆、酶切鉴定及回收
• 2.2.3.5 粘连反应
• 2.2.3.6 将表达载体转化到大肠杆菌中进行扩增
• 2.2.3.7 重组质粒的提取，酶切鉴定及PCR检测
• 2.2.3.8 重组质粒转化农杆菌
• 2.2.4 拟南芥转基因植株的获得
• 2.2.4.1 拟南芥的培养
• 2.2.4.2 农杆菌浸染液的制备
• 2.2.4.3 拟南芥的花序浸泡法进行转化
• 2.2.4.4 拟南芥转基因植株的获得
• 第三章 结果与分析
• 3.1 白菜脱水应答转录因子基因BPDREB的扩增、克隆、测序及序列分析
• 3.1.1 白菜秋绿60基因组DNA的提取
• 3.1.2 白菜秋绿60转录因子基因BPDREB的PCR扩增
• 3.1.3 目的片段的纯化
• 3.1.4 目的片段阳性克隆的鉴定
• 3.1.5 白菜秋绿60转录因子基因BPDREB的序列组成及分析
• 3.1.5.1 转录因子基因BPDREB测序结果
• 3.1.5.2 序列分析
• 3.2.2 基因表达的验证
• 3.2.2.1 白菜中总RNA的提取及反转录
• 3.2.2.2 目的片段的扩增
• 3.2.2.3 目的片段的克隆及测序
• 3.3 白菜中脱水应答转录因子基因BPDREB表达载体构建
• 3.3.1 提取PCAMBIA1031质粒
• 3.3.2 扩增带有BglⅡ和BstEⅡ酶切位点的序列
• 3.3.3 接头目的片段的克隆、酶切鉴定及回收
• 3.3.4 表达载体的连接正确性的鉴定
• 3.3.5 表达载体转入农杆菌后，进行PCR鉴定
• 3.3.6 浸染法转化拟南芥
• 3.3.7 转基因植株的获得
• 第四章 讨论
• 4.1 实验方法讨论
• 4.1.1 PCR体系的优化
• 4.1.2 克隆体系的优化
• 4.1.2.1 纯化产物浓度的确定
• 4.1.2.2 重组子筛选与鉴定的方法
• 4.1.3 表达载体构建体系的建立与优化
• 4.1.4 拟南芥的培养方法的改进
• 4.2 研究结果的讨论
• 4.3 本论文对植物抗逆研究的意义
• 4.4 研究拓展方案
• 4.4.1 利用RNA干涉研究基因功能
• 4.4.2 对目标植物进行转基因实验
• 第五章 结论
• 5.1 目的基因BpDREB的获得
• 5.2 cDNA对目的基因功能的初步验证
• 5.3 表达载体的构建
• 5.4 目的基因向拟南芥中的转化
• 参考文献
• 附录
• 致谢