影响红豆杉细胞系稳定生产紫杉醇的因素研究

论文摘要

红豆杉细胞培养技术是解决紫杉醇药源紧张的有效途径之一。研究表明,不同培养方式和代谢调控方法能够有效提高红豆杉细胞合成紫杉醇的能力。但是,目前红豆杉细胞培养仍然没有实现工业化生产,其最重要的原因在于红豆杉细胞在培养过程中不能稳定合成紫杉醇。本论文从细胞水平和分子水平两个方面探讨了影响红豆杉细胞系稳定性的因素,包括细胞均一性、温度、培养基、去甲基化试剂和诱导子的添加,并建立了高效液相色谱法检测基因组DNA甲基化水平。论文主要结果如下:1.建立了一种红豆杉愈伤组织高频诱导的新方法:春季诱导愈伤组织,外植体分解成长约1 cm的带叶柄茎段,MS培养基中添加0.25 mg/L 2,4-D和1.0 mg/L NAA。新诱导的高产曼地亚红豆杉细胞系,紫杉醇平均含量能够达到400μg/g细胞干重。2.探讨了4℃低温介导的红豆杉细胞系稳定传代的工艺:低温保存的红豆杉细胞恢复培养后紫杉醇含量下降严重,二次低温5-7天能够有效地抑制紫杉醇含量的下降。而低温加热激后添加诱导子可以将紫杉醇含量提高到132.2μg/g,比单纯诱导时提高了2.16倍。3.系统研究了不同培养条件对曼地亚红豆杉细胞系稳定性的影响,结果表明,激素水平对红豆杉细胞系的稳定性影响较大,其次是培养基的种类和培养周期,培养方式的影响基本可以忽略。在不均匀的培养体系中,高产细胞的比例占到40%左右时,紫杉醇产量将达到最大。4.研究了红豆杉细胞中DNA甲基化水平改变对紫杉醇含量的影响。结果表明,添加1 mg/L去甲基化试剂5-Aza-CdR处理12天能够在不显著抑制细胞生物量积累的同时,有效提高紫杉醇含量。去甲基化试剂对中国红豆杉细胞的生长抑制作用更为强烈,对紫杉醇含量的提高也更为明显。和诱导子协同作用时能使曼地亚红豆杉细胞中的紫杉醇含量达到362.2μg/g,比对照提高了6.19倍;而中国红豆杉细胞中紫杉醇含量能够提高到对照组的8.16倍。5.建立了一套适合红豆杉细胞基因组DNA甲基化检测的高效液相色谱法,通过重复试验证明此方法具有良好的稳定性和重现性。用该技术分析得知,中国红豆杉细胞的甲基化水平普遍高于曼地亚红豆杉细胞;去甲基化试剂5-Aza-CdR对紫杉醇含量的提高确实与DNA甲基化水平的降低有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪言
• 1.1 细胞培养生产抗癌药物紫杉醇的前景及瓶颈
• 1.2 植物细胞培养过程中次生代谢产物含量不稳定的机理
• 1.3 DNA甲基化研究进展
• 1.4 本文的研究内容及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 原理与方法
• 3 结果与分析
• 3.1 不同产量的红豆杉细胞纯系的建立
• 3.2 环境因素对红豆杉细胞中紫杉醇含量和稳定性影响
• 3.3 红豆杉细胞基因组DNA甲基化水平改变对紫杉醇含量的影响
• 3.4 高效液相色谱法检测细胞甲基化水平方法的建立
• 4 讨论
• 4.1 红豆杉细胞系的建立方法比较
• 4.2 环境因素影响次生代谢产物的稳定性
• 4.3 甲基化水平改变对细胞中次生代谢产物的影响
• 4.4 甲基化检测方法的建立与评价
• 5 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献