论文摘要
结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis）是引起结核病的病原体。耐药结核病的传播和耐药结核病在艾滋病（AIDS）病人中多次爆发流行导致结核病疫情在全球范围出现回升局面,而现有的抗结核药物不能有效地治愈结核病,导致结核病患者的死亡率显著增加。因此,迫切需要研发有效的抗结核新药。结合分枝杆菌的细胞壁在其生存和增殖过程中起着重要的作用,其核心结构由肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖、分枝菌酸三种组分连接组成。被分枝菌酸脂化的聚阿拉伯糖与聚半乳糖通过衔接双糖（L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺）共价连接到肽聚糖分子上。在肽聚糖和二糖连接分子中共有的组成成分是N-乙酰葡糖胺,因此,影响N-乙酰葡糖胺合成的因素都可作为新药的理想靶标。根据生物信息学的比对,发现结核分枝杆菌Rv1018c编码的蛋白质与大肠杆菌的GlmU蛋白有一定的同源性（37%）。大肠杆菌中的GlmU是一种双功能酶,在UDP-N-乙酰葡糖胺的合成过程中催化了两步连续的反应:（1）催化葡糖胺-1-磷酸生成N-乙酰葡糖胺-1-磷酸;（2）催化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸生成终产物UDP-N-乙酰葡糖胺,UDP-N-乙酰葡糖胺作为N-乙酰葡糖胺的糖基供体,参与肽聚糖和二糖连接分子的形成。为了鉴定结核分枝杆菌Rv1018c （glmU）的功能,我们首先要克隆编码结核分枝杆菌的Rv1018c（glmU）基因,然后利用大肠杆菌高效表达Tb GlmU蛋白,利用酶促反应法鉴定Tb GlmU蛋白的功能。本论文的目的是:（1）用PCR方法扩增出正确的目的Tb glmU基因;（2）将Tb glmU基因克隆到pBluescript II KS（-）克隆载体中,经DNA序列测定证实为正确的基因;（3）将Tb glmU基因克隆到pET16b表达载体中并通过大肠杆菌BL21（DE3）中表达Tb GlmU蛋白;（4）用亲和层析法纯化重组GlmU蛋白,并用Western Blotting方法鉴定Tb GlmU蛋白;（5）用高效液相色谱法鉴定Tb GlmU的双功能酶活性。本论文所获得的结果如下:1.用PCR方法对目的基因Tb glmU的扩增从结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组数据库（http://geno- list.pasteur.fr./TubercuList/）中获得Tb glmU基因的核苷酸序列（1488bp）。根据其核苷酸序列设计一对PCR引物,并在上游引物和下游引物的5’端分别引入NdeI和XhoI限制性内切酶位点。以便将Tb glmU基因克隆到pET16b表达载体的NdeI和XhoI位点。用具高保真的Vent DNA聚合酶,以H37Rv菌株基因组DNA为模板成功扩增了Tb glmU基因。2. pBS-Tb glmU的构建及核苷酸序列测定将纯化的PCR产物与pBluescript II KS（-）载体进行连接,然后将连接产物转化入大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中。用限制性内切酶酶切的方法鉴定阳性重组质粒。对pBS-Tb glmU中的Tb glmU基因进行DNA序列测定,对DNA测序结果进行BLAST分析,结果表明所克隆的Tb glmU基因与结合分枝杆菌H37Rv菌株基因组数据库中glmU基因序列完全一致,表明利用PCR技术扩增出的Tb glmU基因不存在任何碱基突变。3.表达载体pET16b-Tb glmU的构建用NdeI和XhoI双酶切pBS-Tb glmU质粒,回收和纯化glmU基因,将其连接到pET16b表达载体的NdeI和XhoI位点,构建pET16b-Tb glmU表达质粒。用NdeI和XhoI双酶切的方法鉴定阳性重组质粒。GlmU蛋白的N端与质粒上的组氨酸标签形成融合蛋白。4. Tb GlmU蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达和纯化将pET16b-Tb glmU质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中,用不同条件（IPTG的浓度、诱导温度及诱导时间等）诱导携带pET16b-Tb glmU质粒的BL21（DE3）表达重组蛋白。用超声方法破碎诱导后的BL21（DE3）,对上清和沉淀组分进行SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明Tb GlmU蛋白在BL21（DE3）中可溶性表达。采用组氨酸-Ni2+亲和层析技术纯化Tb GlmU蛋白,对纯化的蛋白进行蛋白质定量（考马斯亮蓝法）,第2洗脱组分（1 ml） Tb GlmU蛋白的浓度为0.533 mg/ml。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明我们获得了纯Tb GlmU蛋白。5.用高效液相色谱法对Tb GlmU蛋白的酶活性测定将反映底物葡糖胺-1-磷酸、乙酰辅酶A与纯化的Tb GlmU酶蛋白在37℃反应30分钟,结果显示出现了产物N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的吸收峰,证明了纯化的Tb GlmU蛋白具有葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性。将反应底物焦磷酸、UDP-乙酰葡糖胺和纯化出的Tb GlmU蛋白在37℃反应30分钟,结果显示出现了产物N-乙酰葡糖胺-1-磷酸的吸收峰,证明Tb GlmU蛋白有N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷转移酶活性。结论:在本研究中,我们构建了pET16b-Tb glmU表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达出大量的可溶性Tb GlmU蛋白。用高效液相色谱的方法对纯化后的Tb GlmU蛋白进行功能鉴定,确定了Tb GlmU蛋白有葡糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶和N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷转移酶活性。这一研究结果为我们建立Tb GlmU的酶抑制剂筛选模型奠定了基础。
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标签：结核分枝杆菌论文; 乙酰葡萄糖胺论文; 葡糖胺磷酸乙酰基转移酶论文;